《生物芯片分析报告》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物芯片分析报告（114页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生物芯片 (Biochip),武汉大学生物医学工程系 赵 旻,本章提纲,生物芯片简介与沿革 生物芯片的分类 基因芯片基本原理、流程与应用 蛋白质芯片及应用 其它芯片技术,第一节 生物芯片简介与沿革,什么是生物芯片? 生物芯片(Biochip)主要指通过平面微细加工技术，在固体芯片表面等载体上的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。,芯片上每平方厘米可密集排列成千上万个生物分子(Microarray)，能快速准确地检测细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分，并获取样品中的有关信息，其效率是传统检测方法的成百上千倍。,生物芯片分析基本流程,建立,
2、1996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片，并制作出相应的芯片系统。此外，美国的Hyseq公司、Aurora公司、Nanogen公司、Incyte公司等也在积极开展DNA芯片研究工作。近二年，摩托罗拉、惠普、IBM等跨国公司也相继投以巨资加入生物芯片的研究开发。,中国在生物芯片领域起步较晚，我国是从一九九七年才开始对生物芯片研究，而国外从八十年代起就开始研制生物芯片。 中国医药生物技术协会生物芯片分会国际生物芯片领域的第一个行业性组织2006在北京成立。 中国在北京、上海、陕西、天津、南京建立了五大生物芯片研发和产业化基地 。 我国生物芯片
3、产业尚未形成统一的技术标准，不规范。在产品认证认可方面也存在与国际惯例不接轨的情况。,第二节 生物芯片的分类,一般分类,根据用途还可以把生物芯片分为两类： 信息生物芯片和功能生物芯片,第三节 基因芯片 基本原理、流程与应用,本节内容提要,1. 简介 2. 图像处理与数据标准化 3. 基因芯片的数据分析 4. 芯片工具&数据库,简介,基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及检测等研究的技术。,基
4、因芯片发展历史,Southern & Northern Blot,Dot Blot,Macroarray,Microarray,基因芯片,1. 根据免疫测定的 (immunoassay)的方法 予以改进 2. 高通量、点阵以及Northern杂交 3. 同时测定细胞内数千个基因的表达情况 4. 芯片的体积非常小：微量样品的检测 5. 基因表达情况的定量分析,基因芯片的原理,依据双螺旋原理，核酸分子杂交技术，在靶标样品与探针之间进行选择性反应，将反应一方(探针)固定在芯片上，另一方(荧光标记,即制备好的cDNA，分别标记绿色的Cy3和红色的Cy5)通过流路或加至芯片上。,核酸杂交,RNA,DNA
5、1,DNA2,Probe,Southern hybridization,Northern hybridization,Juang RH (2004) BCbasics,基因芯片的密度：100-1 million DNA 探针/1cm2,将样品中的DNA/RNA表上荧光标记，则可以定量检验基因的表达水平,碱基互补,基因芯片流程,样品制备,芯片制备,杂交,杂交信号检测,数据分析,实验流程,基因表达情况的定量测定,1. 发现在特定生长时期，或者随着环境变化，那些基因的表达收到诱导或者抑制 2. 在相同条件下，上调或者下调变化规律相似的基因，可能具有功能上的关联 3. 可以从共表达的基因中寻找调控模体
6、 4. 基因表达的模式可以用来表征异常的细胞调控，例如，癌症的诊断,基因芯片分类,按芯片制备方法分类 原位合成芯片（synthetic genechip） DNA微阵列芯片（DNA microarray） 按探针分类 寡核苷酸阵列（芯片） DNA阵列 基因芯片 cDNA芯片 RNA芯片,Comparison of DNA Chip Technologies,Sensitivity of DNA chip based assays is a function of: Probe and target DNA/RNA (Complexity) Chip surface (autofluoresce
7、nce & non-spec. bkg) Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency & crosshyb.) Hybridization efficiency (lots of factors) Detection technology (signal type, efficiency, noise),Oligo-Chip cDNA-Chip Genomic Chip 8 n or 20 n 50,000 n,sequencing,expression,expression,genomic analysis,基因芯片技术的类型,按技术手
8、段、探针类型分类 1. Short oligonucleotide arrays (Affymetrix) 2. cDNA arrays (Brown/Botstein) 3. Long oligo arrays (Agilent) 4. Serial analysis of gene expression (SAGE) 按实验要求分类 1. 单通道 (Single Channel): 一次检验一种状态 2. 双通道 (Dual Channel): 差异表达基因的筛选,1 片上原位合成寡核苷酸点阵芯片（ONA） 2 微量点样技术制作的CDNA 点阵芯片（CDA） ONA特点： （1）易寻址，利
9、用组合化学的原理安排各寡核苷酸的位点，芯片反应后易寻址； （2）点位牢固，用表面化学方法处理基片(玻璃、硅片、尼龙片)，使核苷酸固定在基片上； （3）定点合成，光导向平板印刷技术，芯片表面可用屏蔽物屏蔽，光照选择性脱保护，有利于定点合成寡核苷酸中的各个碱基；目前技术：1.6cm2；40万个点；20个核苷酸；,两类主流的DNA芯片,1. cDNA microarrays: 将5005,000bp的cDNA固载到介质上 (例如玻璃)，Stanford开发设计，通常为双通道 2. DNA chips: 将寡核苷酸探针 (2080-mer) 合成到芯片上，Affymetrix开发设计，通常为单通道,(
10、1) cDNA microarrays,cDNA clones,Robot spotter,普通的盖玻片,cDNA microarrays的制备,差异表达基因的筛选,Treatment / control Normal / tumor tissue Brain / liver ,点样后的cDNA Microarrays,Genes,mRNA samples,Gene expression level of gene i in mRNA sample j,=,Log (Red intensity / Green intensity),Log(Avg. PM - Avg. MM),sample1
11、sample2 sample3 sample4 sample5 1 0.46 0.30 0.80 1.51 0.90 . 2 -0.10 0.49 0.24 0.06 0.46 . 3 0.15 0.74 0.04 0.10 0.20 . 4 -0.45 -1.03 -0.79 -0.56 -0.32 . 5 -0.06 1.06 1.35 1.09 -1.09 .,基因表达的数据,(1) DNA chips,DNA chips的制备：Affymetrix photolitography,探针长度：25 bp 每个基因：22-40个探针 Perfect Match (PM) vs. MisMa
12、tch (MM) probes,点样后的Gene chip,总结,基因芯片的实验流程,2. 图像处理与数据标准化,单通道基因芯片 white (very high) red (high) Yellow (a little high) green (medium) blue (low) black (no),图像处理,植根区域生长法(SRG),Fixed Circle,栅格化：确定点的位置 图象分割 (Segmentation)：将点从背景中分离出来。 抽提亮度：各个像素亮度的平均值 (mean)或中位数 (median) 背景校正：局部或全局,基因表达量的定量,对于每个点，我们可以计算 Red
13、 intensity = Rfg - Rbg fg = foreground, bg = background, and Green intensity = Gfg - Gbg and combine them in the log (base 2) ratio Log2( Red intensity / Green intensity) Green intensity (medium): 1,Microarray: 误差的来源,系统的 随机的,log signal intensity,log RNA abundance,Microarray: 误差的来源,1. 图像分析 2. 扫描 3. D
14、NA杂交过程， 温度、时间、混合均匀程度等 4. 探针的标记 5. RNA的抽提 6. 加样 7. 其他,Red/green 比值存在亮度的倾向,M = log2R/G = log2R - log2G,= (log2R + log2G )/2,Values should scatter about zero.,数据标准化,before,after,3. 基因芯片的数据分析,(1) 差异表达基因的分析 (2) 基因共表达分析 (3) 基因表达数据的聚类 (4) 基因表达数据的分类 (5) Map to GO (6) Gene regulatory network,(1) 差异表达基因的分析,1.
15、差异表达基因的分析: 寻找处理前后表达上调或者下调的基因 2. Are the treatments different? 3. 使用标准的统计学方法检验 (t-test or f-test)，发现统计显著性差异表达的基因， 4. 如果处理本身并不显著，则结果无意义,统计学分析,1. Fold change, 一般2-fold increase or decrease (平行实验的样本较少) 2. p-value (平行实验的样本较多),P-value: 学生分布,1. T-test: 学生分布 2. Excel函数：TTEST(array1,array2,tails,type) Array1
16、为第一个数据集 Array2为第二个数据集 Tails指示分布曲线的尾数。如果 tails = 1，函数 TTEST 使用单尾分布。如果 tails = 2，函数 TTEST 使用双尾分布 Type为 t 检验的类型 1 成对 2 等方差双样本检验 3 异方差双样本检验,P-value: 学生分布,1. 一般选择双尾分布 2. 异方差双样本检验 3. Excel函数：=TTEST(B2:D2,E2:G2,2,3) 4. C：对照组；T：实验组,Multiple Comparisons,1. 在基因芯片的实验中，每一个基因/探针，都是一个独立的实验 2. 基因芯片：高通量，1,000个基因/探针 3. 因此，无论怎么比较，总会有一些基因会是
