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1、中国医科大学 博士学位论文 全氟辛烷磺酸（PFOS）对小鼠免疫毒性效应研究 姓名：董光辉 申请学位级别：博士 专业：劳动卫生与环境卫生学 指导教师：何钦成 20090401 中文论著摘要 全氟辛烷磺酸( P F O S ) 对小鼠免疫系统毒性效应研究 上- J L 一 刖 吾 全氟辛烷磺酸( P e r f l u o r o o c t a n es u l f o n a t e ，P F O S ) 是近年来引起科学家们关注 的一种新型持久性有机化合物，该有机物被广泛用于机械润滑剂、涂料、农药和 医药品、表面活性剂、纺织品和皮革制品表面防污剂、泡沫灭火剂等数百种工业 和日用品生产领域。由
2、于P F O S 在自然界中的难降解性和生物体内的高蓄积性， 其已经在生态系统中得到广泛的传播，并且正在通过食物链途径的生物浓缩和生 物放大进行生物种群间的转移，最终高浓度地蓄积在食物链高位生物包括食肉动 物和人体内。2 0 0 4 年杜邦公司“不粘锅事件”进一步引起了国内专家对P F O S 的关 注。 P F O S 分子是由17 个氟原子和8 个碳原子组成的烃链，烃链末端碳原子上连 接一个磺酰基。这种化学结构特点使分子中烃链碳原子间的共价键不容易受到外 界作用而产生断裂。研究资料表明，P F O S 即使在浓硫酸或浓硝酸溶液中煮沸l 小时也不分解，或在9 8 硫酸中经过2 8 天P F
3、O S 浓度也未见任何降低。与以往持 久性有机污染物不同，P F O S 具有疏水、疏油脂特性，虽然同属于持久性有机污染 物，但是不蓄积在脂肪组织中，大部分与血浆蛋白结合存在于血液中，其余分布 在动物肝脏、少量分布于肌肉和脑等其它组织中。研究表明，生物体内的P F O S 主要来自食物、饮水、含P F O S 泡沫灭火剂气溶胶吸入或体内含P F O S 系列产品 的降解。有研究表明，一个7 0 k g 体重的成年人通过饮食每天摄入P F O S 的量约为 6 2 5 - 7 4 2n g 。人群血清流行病学调查显示，各国各族人群血清中均检测出不同浓 度的P F O S 污染，其中职业暴露人群血
4、清中P F O S 浓度高达1 2 8 3 m g L ；甚至新生 儿血清中也存在P F O S 污染。最近研究结果显示，人类血清中P F O S 生物半衰期 平均为8 6 7 年( 范围为2 2 9 - 2 1 3 年，S D = 6 1 2 ) ，最高达2 1 3 年。而更值得关注的 是，人体内P F O S 负荷里逐年增高趋势。日本学者的调查结果显示，在1 9 8 3 1 9 9 9 年期间，人群血清中P F O S 浓度以每年O 4 9u g m 速度递增。我国沈阳地区人群 血清P F O S 浓度从1 9 8 7 年的0 0 3 u g L 增加到2 0 0 2 年的2 2 4 u
5、g L ，1 5 年间人群血 清中P F O S 浓度增加了7 4 7 倍。 P F O S 的大鼠一次经口半数致死剂量( L D s o ) 为2 5 1 m g k g ，按照W H O 定义 标准，P F O S 应属于中等毒性物质。人群流行病学调查显示，P F O S 可降低新生儿 体重，并使职业人群患膀胱癌和前列腺癌的危险性增高。毒理学研究表明，P F O S 可对机体的神经系统、生殖系统和内分泌系统产生损伤，并具有胚胎发育毒性和 遗传毒性，表明P F O S 可能为一种全身毒性物质。免疫系统是对外源性化合物最 为敏感的系统之一，但是，目前对于P F O S 材料引起的免疫毒性研究刚
6、刚起步， 资料甚少，现有的为数不多的研究主要集中在P F O S 对某些有限的免疫指标的毒 性效应上，而关于P F O S 免疫毒性的系统研究未见报道。所以，全面研究P F O S 的免疫毒性，了解P F O S 对免疫系统的危害，阐明P F O S 免疫毒性剂量一效应关 系和毒作用机制，可使人们深入了解P F O S 危害性，在P F O S 环境安全性评价中 提供科学依据。因此，本研究在观察P F O S 短期染毒、亚慢性染毒和体外染毒对 小鼠免疫系统毒性的基础上，应用E L I S A 、流式细胞分析等方法进一步探讨P F O S 对小鼠细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫等的影响，从分子水
7、平上评价P F O S 对小鼠免疫系统毒性效应。 材料与方法 一、试验动物染毒方式和样品制备 l 、P F O S 配制方法： 试验组配制：配制2 T w e e n8 0 溶液，按照设计剂量加入全氟辛烷磺酸钾盐 ( P F O S K ) 配制P F O S 溶液。对照组配制：配制2 T w e e n8 0 溶液。 2 、短期染毒 8 1 0 周的雄性C 5 7 B L 6 小鼠4 8 只，实验室内适应性喂养7 天后按体重随机 分为4 组，每天一次经口灌胃染毒，试验组每天P F O S 染毒剂量分别为5 、2 0 、 4 0 m g k g ( b w ) ，对照组给予2 T w e e
8、n 一8 0 。每天一次经口灌胃染毒7 天。 3 、亚慢性染毒 将8 1 0 周的雄性C 5 7 B L 6 小鼠6 0 只，实验室内适应性喂养1 0 天后按体重随 2 机分为6 组，每天一次经口灌胃染毒6 0 天，试验组6 0 天P F O S 累计染毒剂量 T o t a l A d m i n i s t e r e dD o s e ( T A D ) 】分别为O 5 、5 、2 5 、5 0 、1 2 5 m g k g ( b w ) ，即每天染毒 剂量分别为8 3 3 、8 3 3 3 、4 1 6 6 7 、8 3 3 3 3 、2 0 8 3 3 3 9 9P F O S l
9、 【g ( b w ) ，对照组给予 2 T w e e n 8 0 。 4 、体外染毒 1 0 周雄性C 5 7 B L 6 小鼠6 只，无菌取脾制备脾细胞悬液，调整脾细胞终浓度 至l x l 0 7 m L ，取2 0 0 斗t 孔加入2 4 孔培养板中。将P F O S ( 以D M S O 为溶剂) 按0 、 1 、5 、1 0 、5 0 、2 0 0 、3 0 0 9 M 的浓度加入2 4 孔培养板中，3 7 0 C 、5 C 0 2 的细胞培 养箱内培养4 8 小时，提取培养上清，检测细胞因子水平。 5 、脾细胞采集 短期染毒后第8 天或亚慢性染毒第6 1 天，摘除眼球采血并收集血
10、清，颈椎脱 位处死小鼠，7 5 酒精浸泡，取出各组小鼠的胸腺、肾脏、肝脏、脾脏，称量质 量，并计算器官指数。常规制备脾细胞悬液，用含2 热灭活F C S 的P B S 将脾细 胞终浓度调至l x l 0 7 m L 。 二、免疫指标测定方法 1 、血清中P F O S 浓度测定 0 5 m L 血清样品加入1 0 m LO 5 m o l L T B A H S 和2 5 m L0 2 5 m o l L 碳酸氢钠缓冲 液，振荡混合2 0 m i n 后加入5 0 m LM T B E 进行萃取，离心后，收集上层M T B E 相。 沉淀物部分再次加入5 0 m LM T B E ，进行2 次
11、萃取。两次萃取合并液用高纯氮吹 干后，准确加入1 0 m L 甲醇进行定容，进行H P L C M S 定量分析。 2 、C D 4 + 、C D 8 + 细胞亚群检测 取0 1 m L 脾细胞悬液，加入a n t i - C D 3 一F I T C ( 5 5 3 0 6 1 ) 、a n t i C D 4 - P E ( 5 5 7 3 0 8 ) 、 a n t i C D 8 一P E R C P ( 5 5 3 0 3 6 ) 0 2 p g ，4 。C 下避光孵浴3 0 m i n 。加2 m LP B S 、混匀，离心 5 m i n ( 2 0 0 0 r m i n )
12、，弃上清。将剩余液体转入流式管。流式细胞仪的激发波长为 4 8 8 n m ，利用F A C SC E L L Q U E S T 软件获取细胞，每个样品分析1 0 ，0 0 0 个细胞；记 录C D 4 + T 细胞、C D 8 + T 细胞的个数百分比。 3 、N K 细胞活性检测 以Y A C 1 细胞作为靶细胞，调整靶细胞浓度至1 x 1 0 5 m l 备用。取脾细胞 ( 1x 1 0 6 m 1 ) 和靶细胞各0 1 m l 加入9 6 孔细胞培养板中，每份标本设三个复孔， 同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组。用酶联检测仪在4 9 0 n m 波长下 读各孔O D 值，计算
13、N K 细胞活性。 4 、M T T 法检测淋巴细胞增殖 用含1 0 d 、牛血清的R P M I 1 6 4 0 培养液调整脾细胞浓度为5 x 1 0 6 m L ，加入 9 6 孔培养板，每孔1 0 0 肛1 脾细胞悬液。每孔加入1 0 p g m l 的C o n A 或L P S l 0 0 p I ， 同时设只加培养液的阴性对照，每组设3 复孔。在酶标仪上于5 7 0 n m 处测光吸收 值( A ) ，以下列公式计算淋巴细胞增殖指数( S I ) ：S I = , I J 激孔A 值对照孑LA 值。 5 、N O 测定 取脾细胞培养上清接入9 6 孔培养板中，l o o “1 孔，
14、将1 0 0 9 m o V LN a N 0 2 在9 6 孔培养板中进行倍比稀释。各孔中再加入O 1 m lG r i e s s 试剂，室温静置l O m i n ，在 5 5 0 n m 波长处测O D 值。 6 、B 细胞溶血空斑试验测定 将绵羊红细胞( S R B C ) 免疫过的小鼠脾细胞制成2 x 1 0 6 m l 悬液，与0 1 m lS R B C 和0 0 5 m l 的D E A E 右旋糖酐补体在琼脂凝胶内混合，冷却凝固后放入3 7 0 C 温箱 1 小时，加入豚鼠血清1 S m l 。记录整个平皿中溶血空斑数。 7 、E L I S p o t 法检测I L 2
15、和I L 1 0 细胞数量 采用E L I S p o t 法检测脾脏I L 2 和I L 1 0 的细胞数量，调整脾细胞浓度分别为 1 x 1 0 5 m l ( I L - 2 ) 和1 x 1 0 6 m l ( I L - 1 0 ) 。每孔加入1 0 0 p t l 脾细胞悬液和对照品，3 7 0 C C 0 2 温箱孵育1 h 。每孔加1 0 0 1 a l 生物素标记的I L 2 或I L 1 0 检测抗体，4 0 C 过夜孵育。 加入碱性磷酸酯酶标记链霉亲和素l o o 岍L ，室温孵育2 h 。加入B C I P N B T 显色 液l o o 邮L ，避光孵育l h 。E
16、L I S P O T 自动分析仪读板计数I L 2 或I L 1 0 细胞数量。 8 、E L I S A 法细胞因子I L 2 、I L 4 、I L 1 0 、I F N 湖0 定 采用双抗体夹心E L I S A 法：每孔加入5 0 p , l 倍比稀释的标准品，对照品或培养 上清，混匀1 r a i n 。室温孵育2 h 。每孔加入1 0 0 1 a l 各细胞因子多克隆抗体，室温孵 育2 h 。1 0 0 “l 孔加入酶标记溶液，室温避光孵育3 0 m i n 。加入l o o u 讶L 终止液。用 酶标仪在4 5 0 n m 波长读记吸光度O D 值。 4 9 、血清抗体I g G 、I g M 测定 采用E L I S A 检测血清抗体水平：1 0 0 “l 孔标准品加入到9 6 孔酶标板中，每孔 加入1 0 0 9 l 血清，加入5 0 r d 孑L 酶标记溶液，3 6
