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1、兔骨髓间充质干细胞自体移植修复关节软骨缺损的初步研究 杨劲松，杨渊z ( 1 广西南宁市第一人民医院；2 广西O N 骨伤科研究所) 关节软骨由于自身结构缺乏血运的特点以及关节面处在一个经常受力，反复摩擦， 相互挤压的状态，关节软骨极易受损。局限于软骨内的损伤几乎无修复反应，久之易导 致骨关节退行性变。全层损伤后骨髓参与修复，形成的新生组织多为纤维组织与纤维软 骨，力学性能差，不能满足关节功能需要。以干细胞工程为代表的现代组织工程学是近 年来迅速发展起来的一个新领域。骨髓间充质干细胞的可获得性、可扩增性及可多向分 化性为我们展示了良好的研究与应用前景，在软骨缺损修复中有重要的临床应用价值。 本
2、实验旨在探讨兔骨髓间充质干细胞( M S C s ) 自体移植修复全层软骨缺损的实验效果， 以及纤维蛋白封闭剂( F i b r i nS e a l a n t ，F S ) 作为载体的可行性。 1 材料与方法 1 1 兔M S C s 的提取、分离、培养、传代扩增 取新西兰大白兔1 2 只，4 个月龄，体重2 5 3 0k g 。0 2 5 戊巴比妥钠( 0 2 m l k g ) 静脉注射麻醉，同时用0 7 5 利多卡于手术部位施以局部麻醉，在无菌操作下切 开胫前外侧皮肤，暴露出胫骨，钻出直径5 m m 通髓腔的小孔，插入9 号留置针进髓腔， 外接1 0 m l 注射器，内含3 0 0
3、0U m l 肝素的D M E M 培养液1 0m l ，反复2 3 次冲出 骨髓，经自制的引流器收集到烧杯中，用1 0 0 目的筛网过滤后移至5 0 m l 无菌离心管，1 2 0 0 转分离心，弃上清，加入D M E M 培养基3 m l ，吹散后与P e r c o l l 液( P h a r m a c i a ，比 重1 0 7 3 9 m 1 ) 按1 ：1 的比例进行梯度离心，1 2 0 0 r m i n ，离心2 0 分钟。离心后缓慢吸 取中间交界面乳白色云雾状悬浮细胞，移至另一无菌试管，以D M E M 洗涤2 次，悬浮。 将上述分离所得骨髓中单核细胞按1 0 X1 0
4、6 c m 2 接种于含有1 5 新生牛血清的D M E M ( 同时加有青霉素1 0 0ug m 、链霉素1 0 0 “g r r d ，p H 7 3 ) 的2 5 m l 培养瓶内，作好标 记，于3 7 。C ，5 C O ，1 0 0 饱和湿度条件下进行细胞箱培养。于4 8 小时后除去非贴 壁细胞，同时更换新鲜的培养液，以后每隔2 3 天更换一次培养液，用倒置相差显微 镜( O l y m p u sI X 5 0 ) 观察细胞形态及其生长变化并摄像。约1 2 1 5 天，细胞生长铺满 至瓶底9 0 以上融合时，用0 2 5 胰蛋白酶和O 0 1 依地酸( E D T A ) 消化贴壁
5、细胞，悬 浮。将原代培养1 2 1 5 天的细胞悬液以1 ：3 的比例传代，置入2 5 m l 培养瓶中。经过 传代4 次，M S C s 铺满8 个1 0 0 m l 培养瓶瓶底。 1 2 电镜观察M S O s 收集M S C s 原代和诱导1 4 天的骨髓间充质干细胞，常规超薄切片，扫描、透视电 镜观察细胞外的基质形成情况及细胞超微结构的变化。 1 3 膝关节软骨缺损修复 实验分组：1 2 只实验兔的双侧膝关节内外髁共4 8 个髁，其中随机选1 6 个髁植入自 体M S C s 为实验组，1 6 个髁植入纤维蛋白封闭剂载体( F s ) 为F s 组( M = 1 8 ) ，余1 6 个
6、 髁为空白对照组。仰卧位固定兔作两侧膝内侧切口，膑骨外侧脱位，显露股骨滑车关节 面，用手摇钻造成一直径4 m m 的关节软骨缺损，深达软骨下骨。M S C s 组关节软骨缺损 滴注0 0 5 m l D M E M ( 内含M S C s8 1 0 6 ) ，表面用F S 覆盖，F S 组创腔用F S 覆盖，空 白对照组未作任何处理。1 2 只实验兔按分组进行处理，术后不固定膝关节，笼内饲养， 自由活动。肌注青霉素8 0 万U ，每天2 次，连续3 天。 1 4 组织学观察 术后观察膝关节活动度。在术后1 4 周切取缺损处软骨组织块，中性福尔马林液固定 4 8 小时，脱钙2 天，石蜡包埋，切片
7、，行H E 和M a s s o n s 三色染色。 1 5 诱导M S C s 向成骨细胞分化 在培养第2 代细胞的培养体系中，加入地塞米松2ul ( 终浓度为1 0 “g r n l ，S i g m a 公 司) ，骨形成蛋白一22 5 “l ( B M P 一2 终浓度为6 2 5ug m 1 ，S i g m a 公司) ，D 一磷酸甘油 钠5 0 m m o l m l ( S i g m a 公司) ，每三四天换液，培养2 8 天，观察细胞形态的变化，并于 1 4 天和2 8 天进行碱性磷酸酶和钙结节染色。 1 6 关节软骨组织学产定量计分( 改良自P i n e d a 方法
8、1 1 ) 对股骨内侧髁缺损区的组织从5 个方面进行评分：细胞形态：透明软骨细胞0 ；透 明软骨细胞为主1 ；纤维软骨细胞为主2 ；非软骨为主3 ，全部非软骨4 。基质染色：正染 色0 ；轻度减弱l l 明显减弱2 未着色3 。表面平整：平 3 40 ；中1 2 3 4l l 不平1 4 1 22 l 严重不平 2 30 I1 3 2 3l ， 1 32 与宿主结合：两边结合0 ；一边结合l ；不结合2 。 1 7 疗效评定1 2 1 对股骨内侧髁缺损修复区各组1 4 周时的疗效按下列标准进行评定。完全愈合：缺损 区内分化正常罗骨细胞被基质包绕，分层排列，产生组织表面平滑，与周围组织紧密相 连
9、，不完全愈合：修复组织软骨细胞分化较差，或含幼稚软骨细胞，细胞排列不规则，新 生组织表面平滑或粗糙，与周围组织完全或部分连接，未愈合：缺损区内含极少量软骨 组织，由纤维肉芽组织修复，表面凹陷，与周围组织部分连接或不连接。 2 结果 2 1 兔M S C s 倒置显微镜下的观察结果 初步分离的M S C s 与其他有核细胞混杂在一起，不易区分，M S C s 未贴壁时呈圆球 形，体积较大，M S C s 接种后4h 开始贴壁，贴壁后呈梭形外观的成纤维细胞，2 4h 大 量细胞贴壁并伸展开，2 4 7 2 h 见贴壁细胞明显增大并且分裂增殖，部分区域形成小细 胞集落，数个至数十个细胞不等，短或长梭
10、形外观，部分细胞呈三角形或多角形。4 8 h 后 首次换液，可见大小不等的集落，隔日换液，贴壁细胞体积增大，镜下细胞绝大多数呈 2 9 l 梭形外观的成纤维细胞，有明显的方向性，呈旋涡状、网状、辐射状、无接触抑制，少 量细胞呈三角形、多边形，核居中，1 3 个核仁。其生长活跃，增殖速度及快，原代培 养1 0 - 1 5 天的细胞即铺满培养瓶底9 0 以上融合，传代后生长速度更快，以l ：3 的比 例传代约5 7 天即可培养瓶底，经2 3 次传代后细胞呈单一梭形外观的成纤维细胞。 2 2 兔M S C s 的组织学观察 常规H E 染色光镜下，细胞为长梭形、少数为多角形，可有突起，细胞核圆形，位
11、 于胞体中央，蓝色，胞浆为淡红色。碱性磷酸酶染色为阴性或弱阳性，向成骨细胞诱导 后，5 0 碱性磷酸酶染色为强阳性或阳性。钙结节染色也可以看到明显的钙结节。 2 3 M S C s 的电镜观察 透射电镜观察细胞核较大，大多数呈不规则形，少数为椭圆形，含1 3 个核仁， 胞质内有丰富的细胞器，如线粒体、粗面内质网、高尔基复合体等。细胞间还可见到一 些细胞膜局部电子密度增高的缝隙连接。M S C s 胞体较小，核浆比例大，染色质较疏 松，核仁明显，胞浆内细胞器不发达，表现出早期细胞的特点。 扫描电镜观察可见铺于经处理玻片上的细胞呈细长梭形或多角形，细胞表面有短 而粗的微绒毛突起。梭形细胞脑浆向两极
12、伸出长突起，多角形细胞突起星树枝状，紧紧 贴于盖玻片上，细胞周围有薄纱样的基质成分存在。 2 4 兔膝关节软骨创面的修复 2 4 1 大体观察术后头三天，所有试验兔均稍跛行，膝关节轻度肿胀，活动减少， 以后则肿胀逐渐减少，活动逐渐增加，1 0 天左右活动自如，在大的饲养箱内随意活动。 伤口愈合良好，无感染征象。 术后1 2 周空气栓塞处死1 2 只实验兔。标本大体观察见M S C s 组关节液呈淡黄色透明 澄清液，滑膜组织略增加，无明显充血，软骨创面的修复大多数平整，有四处高于正常 的软骨平面，其中一处明显高出，三处轻微高出，色泽接近正常软骨组织，略显苍白，同 邻近正常软骨结合紧密，不易分清。
13、F S 组和空白组缺损处被纤维组织占据，且大部分修 复不全，明显凹陷缺损，与周围正常组织分界清晰。 2 4 2 组织学观察在移植后1 2 周，M S C s 组优势组织是透明软骨，浅层有少许纤维 软骨，深部为骨小梁，表面平整或稍凸，基质着色正常，软骨厚度正常或稍厚，与周围 软骨完全结合分界不清，组织中未发现淋巴细胞浸润；F S 组与空白组仍为纤维组织，部 分有残留明显的凹陷性疤痕，与周围组织分界清。M a s s o n S 三色染色法M S C s 组正常软 骨以及修复区均被染成蓝绿色，而F S 组与空白组仅正常软骨被染成蓝绿色。 2 4 3 关节软骨组织学半定量计分结果对1 2 只新西兰大
14、白兔( 4 8 处缺损) 按改良P i n e d a 方法进行关节软骨缺损修复区的组织学半定量计分。对各组的平均分进行统计学分析， 采用多样本均数比较以及两两比较的检验( 见表1 ) ，结果表明，M S C s 组与F s 组、空白 组两组在软骨组织学半定董计分均有统计学差异( P 0 0 5 ) ，而F S 组和空白组两组则无 差异。 表1修复软骨的组织学评分( x 丁s ) A 组与C 组对照：P O 0 1A 组与8 组对照：P 0 0 5 2 4 4 疗效评价按文献对术后1 2 周的1 2 只动物( 4 8 处) 关节软骨缺损修复区进行 疗效评价，结果如表2 所示，采用X ：检验可知
15、，1 2 周时的修复效果A 组与B 、C 组均有 显著差异( P 0 0 1 ) 。 表21 2 周修复组织疗效评分 A 组与B 、C 组对照：P 0 0 1 3 讨论 3 1M S C s 的取材、体外分离、纯化、培养和扩增 骨髓间充质干细胞取材的常规方法是进行骨髓穿刺，但骨髓穿刺取得的骨髓组织往 往较少，作者采用钻孔冲洗的方法，尽最大程度将骨髓组织冲出，为获得更多的M S C s 提供了可能，从而缩短了体外培养和扩增的时间。骨髓间充质干细胞最初的分离培养方 法是由F r i e d e n s t e i n 在7 0 年代中期建立的。他将骨髓接种于培养皿中，4 h 左右将未附壁 的细胞弃
16、除。这样，大部分的造血细胞及其造血前祖细胞增多被丢弃，保留下来的附壁 细胞是非均质的，包含有多种细胞，但绝大部分为梭形，呈史隆性生长，故将其命名为 单位克隆形成成纤维细胞( c o l o n y - f o r m i n gu n i t f i b r o b l a s t ，C F U F ) ，具有分化为骨 与软骨的能力 3 1 ，后来人们将之称为间充质干细胞。到目前为止，底物黏附特性仍是分离 骨髓间充质千细胞最基本的依据。由于全骨髓培养成功率低1 4 】，故梯度离心因简便易行 而成为被普遍采用的辅助手段。作者常规采用1 0 7 3 9 m 密度的P e r c o l l 梯度离心液，去 除骨髓中的血液成分，收获界面部的有核细胞，也有报道【3 1 采用1 0 7 7 9 m 1 密度的梯度 离心液。培养基为低糖型的D M E M 加lO 的新生牛血清，低糖条件比高糖
