核酸-02.

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1、第五章 核 酸,生物化学,第四节 核酸的性质,（一）酸水解 对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键 嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键 利用酸水解可以研究核酸的碱基组成。 （二）碱水解 RNA的磷酸酯键对碱敏感。 DNA抗碱水解。 生理意义： DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。,一、核酸的水解,（三）酶水解 非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3-核苷酸 特异的磷酸二酯酶： 核酸酶,第四节 核酸的性质,一、核酸的水解,1、核酸酶的分类 底物专一性： 核糖核酸酶 RNase 脱氧核糖核酸酶 DNase 作用方式：

2、核酸外切酶（exonuclease)、 核酸内切酶 (endonuclease)。 单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶 磷酸二酯键的断裂方式： 5-（寡）核苷酸 3-（寡）核苷酸,核酸酶,RNase H 作用于DNA-RNA中的RNA链 牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease) , RNase I 最适pH ：7.0-8.2 产物：以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶 RNase T1 耐热、耐酸 产物：以3-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高 RNase T2 产物：以3-腺苷酸结尾的寡核苷酸,核酸酶,2、RNase,核酸酶S1 作用于单链DNA部分 牛胰核

3、糖核酸酶，DNase I 切断双链或单链DNA 产物：以5-磷酸为末端的寡核苷酸 DNA限制性内切酶 具有非常严格的碱基序列专一性,核酸酶,3、DNase,4、N-糖苷酶,以限制性内切酶及连接酶进行核酸剪接,EcoRI,DNA Ligase,EcoRI sticky end,EcoRI sticky end,目标基因殖入质粒并转化宿主菌,1 plasmid 1 cell,重组质粒 转化宿主,目标基因 殖入质粒,限制酶,限制酶,染色体,目标基因,重组 基因,细胞转化,宿主菌,二、 核酸的酸碱性质 核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性

4、，其等电点偏酸性。DNA的pI约为45，RNA的pI约为2.02.5，在pH78电泳时泳向正极。,第四节 核酸的性质,1、碱基的解离,2、核苷的解离,3、核苷酸的解离,4、核酸的滴定曲线,三、 核酸的紫外吸收 碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有强烈的光吸收， max=260nm,第四节 核酸的性质,1、鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。 2、含量计算 1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA

5、） 或：20ug/mL寡核苷酸 3、判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）,第四节 核酸的性质,四、 核酸的变性、复性及杂交,第四节 核酸的性质,(一)变性,核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。,当核酸的氢键在外界因素的影响下,发生断裂,使两条链分开,但不降解.叫核酸的变性.,第四节 核酸的性质,1、影响核酸变性的因素: 1).外因:凡能破坏氢键和碱基堆积力的因素,都是核酸变性的因素.如: A热变性, B酸碱变性（pH小于4或大于11）, C有机试剂变性（尿素、盐酸胍、甲醛）等. 2).内因:A

6、.碱基的含量.(AT易变性,GC不易) B.DNA的均一性. C.碱基的顺序效应.,1).DNA的变性现象 将DNA的稀盐溶液加热到80-1000C,几分钟后,DNA将发生一系列的物理化学性质的改变(宏观表现). 260nm的紫外吸收值升高.(增色效应) 比旋下降. 粘度下降. 浮力密度升高. 酸碱滴定曲线改变. 生物活性丧失.,第四节 核酸的性质,2、DNA的热变性与Tm值,增色效应与减色效应 增色效应：DNA变性过程中，摩尔吸光系数增大。 减色效应：DNA复性过程中，摩尔吸光系数减小。,第四节 核酸的性质,核酸的变性与复性,Garrett & Grisham (1999) Biochemi

7、stry (2e) p.373,增色效应,减色效应,DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。,Hyperchromic Effect 核酸变性观察,Temperature (C),Relative absorbance (260 nm),Tm,Adapted from Voet et al (1999) Fundamental of Biochemistry p.739,DNA变性作用发生在一个很窄的温度范围内。,2、 熔解温度（Tm）： DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。 浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链）A260= 1.37当A

8、260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。 DNA的Tm一般在8295之间,溶解温度 Tm,3、 影响DNA的Tm值的因素,DNA均一性 。 均一性高，变性温度范围越窄，据此可分析DNA均一性 。,溶解温度 Tm,核酸 G+C 组成分越高者 Tm 越大,Relative absorbance (260 nm),Temperature (C),Pneumococcus肺炎球菌 (38%) G+C,E. coli (52%),S. Marcescens 粘质沙雷氏菌 (58%),M. Phlei分枝杆菌 (66%),Adapted from Garrett & Grisha

9、m (1999) Biochemistry (2e) p.372,G-C含量与Tm值成正比。 测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44,核酸 G+C 含量与Tm值成正比,介质中离子强度 离子强度高，Tm高。,Tm值与介质中离子强度的关系,阳离子中和核酸的负电荷而使 Tm 增大,Tm (C),G + C (%),0.15 M NaCl 0.015 M Na citrate,0.01 M phosphate 0.001 M EDTA,DNA分子的复性,(二)、复性,指经加热变性的DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变

10、性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火(annealing)。,DNA分子的复性,复性机制：10-20bp成拉链 热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。 复性速度可用Cot衡量。 Co为变性DNA原始浓度molL-1，t为时间，以秒表示。,变性DNA在适当条件下（一般低于Tm 值2025） ，两条链重新缔合成双螺旋结构。,核酸复性的速度与其基因组复杂度有关,Fraction reassociated,c0t (mole/L sec),1 10 102 103 104 105 106 107 108 109 1010,E. coli,T4,MS2,Mouse satel

11、lite,牛Calf,Poly U/ Poly A,复性所需时间 (长),基因组大小,分子杂交,（三）分子杂交：(hybridization),不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸链之间，即形成所谓的杂化双链，这个过程称为杂交(hybridization)。,1、Southern Blotting DNA样品 酶切 电泳 碱变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影 Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。,(三) 分子杂交,分子杂交,核酸分

12、子间的杂交反应 hybridization,RNA,DNA1,DNA2,探針,Southern hybridization,Northern hybridization,Juang RH (2004) BCbasics,杂交可以发生于DNA与DNA之间，也可以发生于RNA与RNA之间和DNA与RNA之间。,Northern blotting（印迹法）,Southern Blotting 的转印,Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.499,取出转印纸以探针杂交呈色,Alberts et al (2002) Molec

13、ular Biology of the Cell (4e) p.499,2、 Northern Blotting 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。 总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛） 3、 Western Blotting 抗原与抗体的杂交 研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。,Northern blotting（印迹法）,菌落转印到滤纸后以探针杂合,盖上滤纸,显像呈色,加入探針,转印中,取出滤紙,溶解细胞 核酸变性,Colony hybridization,样本 DNA,每一点上涂布有 已知 DNA,生物芯片,互补的 DNA 会互相杂合,产生 信号,基因芯片利

14、用杂交反应,第五节 核酸研究技术,一、 核酸的分离纯化和定量,尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 抑制核酸酶。,（一）DNA分离纯化 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀。,一、核酸的分离纯化和定量,（二）RNA的制备 RNase 的灭活： 玻璃器皿：140-

15、200 ，8小时； 塑料器皿：0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)，37 ，过夜 提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍 反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂,一、核酸的分离纯化和定量,不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来。 这一方法常用于质粒DNA的纯化。,二、核酸的沉降特性与超速离心,超螺旋DNA或,（一）琼脂糖电泳,用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广,影响迁移率的因素： 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比 凝胶浓度 DNA的构象，超螺旋最快，环型其次，线型最慢。 电压，不大于5V/cm

16、 染色：0.5ug/ml EB RNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛,三、核酸的凝胶电泳,琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定,三、核酸的凝胶电泳,（二）PAGE电泳 以聚丙烯酰胺作支持物，这种凝胶的孔径比琼脂糖胶要小，所以可用于分析相对分子质量小于1000bp的DNA片段和RNA的电泳。聚丙烯酰胺凝胶强度较好，常用垂直板电泳。,三、核酸的凝胶电泳,(一)、 限制修饰系统 限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，构成一个限制修饰系统，甲基化酶使细菌自身的DNA带上标志，限制性内切酶专门用于降解入侵的外源DNA。 限制酶的命名，如：E.coRI 第一位：属名E（大写） 第二、三位：种名的头两个字母小写co 第四位： 菌株R 第五位： 从该细菌中分离出来的这一类酶的编号,四、限制性核酸内切酶与DNA物理图谱构建,（1979年