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1、临床基因扩增检测技术分析前质量控制浙江省基因诊断中心，浙江大学医学院附属儿童医院尚世强DNA双螺旋结构的发现DNA双螺旋结构的发现1951年秋，J.D.沃森和F.H.C.克里克在剑桥相遇共同认识到探索DNA分子结构是认识遗传之谜的关键，并开始合作。他们前后用了18个月的时间，到1953年4月沃森和克里克以以Chargaff规则为基础，经过对DNA晶体的X射线衍射分析，提出了右手DNA双螺旋结构模型。DNA双螺旋结构的分子模型图beganin1953HGP1962年，年，Watson和和Crick共获诺贝尔化学奖。共获诺贝尔化学奖。PCR技术简史1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与
2、合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明6KaryB.Mullis1985年，美国PECetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用EcoliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PECetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis
3、等因此项技术获诺贝尔化学奖PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明7KaryKaryB.MullisB.MullisChainReaction1989年美国Science杂志列PCR为十余项重大科学发明之首比喻1989年为PCR爆炸年Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。83ProjectsManhattanProjectApolloProjectHumanGenomeProject规范化设置：要求参照临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发200210号文）附件临床基因扩增检验实验室基本设置标准医疗机构临床基因扩增管理办法医疗机构临床基因扩增管理办法(卫办发卫办发
4、2010194号文号文）附件）附件医疗机构临床基因扩增检验医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则实验室工作导则PCR技术的质量控制11四个功能区试剂存储和准备区试剂存储和准备区标本制备区标本制备区扩增反应区扩增反应区产物分析区产物分析区12为了方便管理，ISOIEC15189文件将实验过程各环节划分为分析前质量管理、分析中质量管理和分析后质量管理。全面质量管理的划分13全面质量管理阿曼德费根堡姆（ArmandVallinFeigenbaum）全面质量控制之父、质量大师、全面质量控制的作者最早提出全面质量管理概念，努力摈弃当时最受关注的质量控制的技术方法，而将质量控制作为一种管理方法。14临床实
5、验室的全面质量管理2003年3月正式颁布医学实验室质量和能力专用要求（ISOIEC15189），其核心就是加强实验室的全面质量管理。全面质量管理就是按系统学的原理，建立一个体系，使在实验的全过程中所有影响实验结果的要求和环节都处于受控状态，保证每个环节的协调和统一，确保实验结果始终可靠。15ISOIEC15189对于分析前程序的明确定义：按照时间顺序，从临床医生开出医嘱开始，到分析检验程序时终止的步骤，包括检验申请、患者的准备、原始样品的采集、运送到实验室并在实验室进行传输。这个过程大部分工作都是医生、护士、护工等在实验室以外完成的。16分析前质量管理的内涵（定义）定义）分析前质量管理的内涵（
6、定义）定义）患者准备检查患者申请检验标本采集标本运送标本处理人员素质工作环境实验用水实验室管理仪器质量保证方法选择与评价试剂选择与评价建立操作规程室内质控及分析标本分析测定临床医师反馈信息室内复查保留标本随时复查运送报告患者投诉室间质评登记填发报告1718分析前程序的特点分析前程序的特点分析前阶段所占时间比例大。分析前质量管理是最易出现问题、涉及人员最多、潜在因素最多、最难控制的环节。19发生在临床实验室的错误分析发生在临床实验室的错误分析MarioPlebani.ErrorsinclinicallaboratoriesorerrorsinlaboratorymedicineClinicalC
7、hemicalLaboratoryMedicine.2006Volume44Issue6750759Analyticalfactors%oftotalerrorspre-analyticalfactors4668.2post-analyticalfactors18.547intra-analyticalfactors15临床反馈不满意的检验结果，80%的报告最终可溯源到标本质量不符合要求。发生在临床实验室的错误分析发生在临床实验室的错误分析20医疗机构临床实验室管理办法卫医发200673号医疗机构临床实验室管理办法卫医发200673号21第十五条医疗机构和采供血机构应有分析前质量保证措施，应制
8、定患者准备、标本采集、标本贮存、标本运送、标本接收等标准操作规程，标本采集和接收记录完整，并由医疗机构和采供血机构组织实施。审核意见序号审核内容符合基本符合但有缺陷不符合暂不需要考核评论与说明6标本管理6.1实验室有各类患者准备、标本采集、运送、接收（或拒收）、保存或安全处置的具体要求和操作规程6.2标本运送应符合生物安全的要求，组织标本应立刻冷冻并于低温条件下运送，标本采集、运送、接收全程可跟踪6.3在接收标本时应有其状态的详细记录6.4实验室应确定标本是否符合检测要求，拒收标本原因要明确6.5标本检测全过程包括核酸提取、扩增、杂交、保存等都应保持标本的唯一编号6.6实验室应对标本保存条件进
9、行监控和记录临床基因扩增检验及相关分子诊断技术审核表22分析前质量管理要点分析前质量管理要点23123临床基因扩增实验室分析前质量管理临床基因扩增实验室分析前质量管理24软件：软件：1.检测人员：应当经省级以上卫生行政部门指定机构技术培训合格后，方可从事临床基因扩增检验工作。2.临床医生、护士、护工及标本接收人员等需沟通与培训。硬件：硬件：1.试剂储存和准备区2.标本制备区3.扩增反应混合物配制和扩增区4.扩增产物分析区文件：文件：临床基因扩增检验实验室区域设置质量体系文件层次图纲领文件纲领文件支持文件支持文件证实监督文件证实监督文件第四层次：用于质量体系运行的证实依第三层次：具体工作人员使用
10、更详细分析前质量管理相关SOP文件25每类标本或每个项目的特定标本如：血清、血浆、分泌物、尿液、痰、脑脊液、胸腹水及组织等，都应有一个采集、运送、接收和保存的SOP。每类标本或每个项目的特定标本如：血清、血浆、分泌物、尿液、痰、脑脊液、胸腹水及组织等，都应有一个采集、运送、接收和保存的SOP。临床标本的采集、运送、接收和保存临床标本的采集、运送、接收和保存编写目的编写目的基本内容基本内容通过规范相应临床标本的采集方法、所用容器、运送方式、保存条件及接收，确保所采集的标本在检测前的有效性。通过规范相应临床标本的采集方法、所用容器、运送方式、保存条件及接收，确保所采集的标本在检测前的有效性。1.特
11、定标本采集的具体方法和步骤2.明确规定标本的采集容器要求3.明确标本的采集量4.明确标本采集后送到实验室检测所能允许的最大时间间隔5.明确标本采集后，在送往实验室检测前的保存方式和条件6.明确标本从采集处运送至实验室过程中所要求的运送条件7.明确标本接收时，签收的程序、拒收的标准和标本惟一编号的规则8.规定标本在实验室内的短期和长期保存条件和要求9.制定保证标本安全，即如何防止标本丢失、调换、变质的措施1.特定标本采集的具体方法和步骤2.明确规定标本的采集容器要求3.明确标本的采集量4.明确标本采集后送到实验室检测所能允许的最大时间间隔5.明确标本采集后，在送往实验室检测前的保存方式和条件6.
12、明确标本从采集处运送至实验室过程中所要求的运送条件7.明确标本接收时，签收的程序、拒收的标准和标本惟一编号的规则8.规定标本在实验室内的短期和长期保存条件和要求9.制定保证标本安全，即如何防止标本丢失、调换、变质的措施分析前质量管理的核心问题26检验申请表信息充分27患者的唯一标识患者的唯一标识医生的姓名或唯一标识，最终检验报告目的地医生的姓名或唯一标识，最终检验报告目的地原始样品的类型原始样品的类型申请的检验项目申请的检验项目患者的相关临床资料，至少包括性别和出生日期患者的相关临床资料，至少包括性别和出生日期原始样品采集日期和时间原始样品采集日期和时间实验室收到样品的日期和时间实验室收到样品
13、的日期和时间采集血液标本需空腹，脂血干扰核酸测定采集肺结核患者标本，晨起后生理盐水反复漱口后用力深咳病原体感染机体后，特定的临床标本中，病原体含量能达到PCR检出水平的时间点，并不能覆盖整个感染过程，可能只是在感染或疾病发生发展过程中的某一个时间段。如HBV何HCV感染后，在特异抗原和抗体出现以前，血循环中即可有较高浓度病原体存在，而当抗体出现后，病原体的浓度可能会低于PCR或RT-PCR方法的测定下限。标本的采集标本采集时间对扩增结果的影响285.PCR标本应独立收集，密闭运输，不能使用从其他检测如生化、免疫、血液学检测分出的标本。1.血液标本：用于HBV、HCV检测。研究表明对于病原体RN
14、A测定，最好使用EDTA抗凝全血标本（严禁使用肝素），抗凝后6h内分离血浆。如使用血清标本，则需尽快（2h内）分离血清。2.痰液：结合分枝杆菌病检测。3.各种分泌物：泌尿生殖道拭子用于衣原体检测。4.尿液、脑脊液、浆膜腔液、胸腹水和组织等。标本的采集标本的采集类型29肝素对PCR检测的影响肝素能结合并激活全血中多种蛋白酶原和补体系统，由此引起的一系列反应使DNA在提取过程中不断降解。肝素为含多量硫酸基团的粘多糖硫酸酯，溶于水，不溶于有机溶剂。理化性质决定了在DNA抽提过程中，不能被酚、氯仿去除，也不能被乙醇沉淀、洗涤去除。1.肝素对DNA聚合酶具有强大的亲和力，使后者不能与Mg2+作用形成正确
15、的亲引物-模板符合体的活性中心。2.肝素带有强大负电荷，与DNA聚合酶结合后与同样带有较高负电荷的模板DNA之间产生排斥作用。3.肝素携带的强大负电荷中和反应体系中的阳离子如Mg2+和K+，使作为DNA聚合酶辅助因子的Mg2+浓度下降。30使用一次性无菌及无核酸酶的材料绿头管为含肝素类抗凝剂311.患者漱口，用力咳出气管深出第一口痰于清洁干燥无菌的容器内。2.对于无痰或少痰的患者，可用45加温的100gLNaCl水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出。3.对于小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集标本。1.消毒：采集部位如为泌尿生殖道，过度消毒可能会
16、去掉或破坏靶微生物。2.采集：将拭子深入至尿道口2至3厘米处用力旋转1至2圈。标本的采集泌尿道分泌物痰液标本采集过程32标本的运送与保存33标本采集后，应尽快送至检测实验室。1.采集后的所有样本在送至实验室之前，均应暂放在28临时保存。2.靶核酸为DNA的标本，如为无菌条件下采集，可在室温下8h内运送。3.靶核酸为RNA的标本，短时间内的运送（如10min左右），可在室温下运送；如时间较长，则应在加冰条件下运送。如在标本中加入了适当的稳定剂（如GITC）的血标本，则可在室温下运送或邮寄。4.靶核酸为RNA的标本，采集后建议在4h内送至实验室。5.标本运送过程中应充分考虑生物安全问题。有合适的容器转运标本，带盖的透明转运盒，有生物危害标识。标本的验收34标本接收的地点不宜放在在标本制备区，减少实验室污染的机会。可在四区外单独设置或与其他临床标本接收处放在一起。采样质量评价核对标本的采集时间，严格控制标本运送时间标本的唯一性编号交接填表、签名，拒收填表、
