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1、*Free template from 1 普通毒理方法学研究进展 急性经口毒性及皮肤刺激评价试验方法 的研究进展 *Free template from 2 一、急性经口毒性评 价试验方法的研究进 展 概述 急性经口毒性试验是毒理学安全性评价 第一阶段最基础性的试验,LD50是其最为 常用的评价指标。下面主要介绍了传统 的LD50测试法以及3 种主要替代方法(上 下增减剂量法,固定剂量法,急性毒性等级 法) 的优缺点及其实际应用前景。 *Free template from 4 急性经口毒性试验的意义 急性经口毒性试验目的主要是求出受试物 对试验动物的半数致死剂量(LD50 ) 通过 观察急
2、性毒性效应的临床表现,初步估测毒 作用的靶器官和可能的毒作用机制;为亚慢 性、慢性和其他毒性试验的剂量水平设计 提供参考;为急性毒性分级和制定安全防护 措施提供依据。 *Free template from 5 LD50的概念 表示急性经口毒性最常用的指标是LD50（ 半数致死量）。LD50是统计上来源于动物 实验中某一物质单剂量反应引起50%的动 物死亡所需的剂量。 *Free template from 6 LD50的历史溯源 1927 年,英国生物学家Trevn 首先建议测 定一些药物如毛地黄、胰岛素、白喉类毒 素等的毒性大小,用导致50 %动物死亡的 剂量即半数致死量来表示,并发表于皇
3、家学 会杂志上,此即沿用至今的毒理学毒性评价 经典方法之一。 *Free template from 7 LD50历史溯源 Karber速算法 图解法 序贯法 回归直线法 其它方法 *Free template from 8 目前在国外多采用Litchfield 和Wilcoxon 的坐标纸图解法。而我国普遍采用的方法 大体上可以归纳为两类:其一是死亡率-剂 量反应相关要求为正态分布的,其中概率单 位图解法和寇氏法(Karber) 较为常用;另一 类是不要求为正态分布的(非正态分布) ,计 算时只查对有关表格即可得到LD50值,如 霍恩氏法(Horns) 等。 *Free template f
4、rom 9 LD50的意义 LD50值是经统计处理计算得出的数值,与 绝对致死剂量(absolute lethal dose , LD100 ) 、最大耐受剂量(maximal tolerance dose , LD0 ) 等相比有更高的重 现性;其次,它可反映受试群体中大多数动 物易感性的平均情况;最后,从剂量-反应关 系曲线上看,它处于曲线上升的中段,是致 死率对剂量变化最敏感的部位。 *Free template from 10 LD50的测定方法 测定LD50常选用成年小鼠或大鼠两个种属 。先通过预备试验确定正式试验剂量。正 式试验时一般每组10 只动物(雌雄各半) , 在预测的LD1
5、00 及LD0之间安排57 个 剂量组,各组间距应根据受试物的毒性大小 和预备试验结果而定,一般以0.650.85的 等比级数为宜。 *Free template from 11 LD50的缺点 LD50值只能表示一种外源化学物质引起实 验动物死亡一半的剂量(或浓度) ,即只能表 示动物一半死亡、一半存活剂量点的界限, 所以是一个质化反应,而不能代表受试化学 物质的急性中毒特性。因此,只用LD50 来 说明某一外源化学物质的急性毒性是不完 善的。有时,根据实际需要还应进行联合毒 性试验等以获取其他有关试验参数,并仔细 观察动物的中毒症状,以综合评价化学物质 的急性经口毒性效应。 *Free t
6、emplate from 12 替代方法的兴起 新的替代性实验方法的兴起可追溯到1876 年英 国政府颁布的关于禁止虐待动物法,其中在 动物实验法则中明确了动物的权益和动物保护的 原则。 1959 年动物学家Russell 和微生物学家Burch 对 动物实验提出了减少(reduction) 、替代 (replacement) 、优化(refinement) 的3R 概念,即 在生命科学研究中应采取其他手段来代替动物实 验,改进实验方法,减少动物数量和痛苦,但在当时 并没有引起世人的重视。 *Free template from 13 替代方法的兴起 直至20 世纪80 年代,随着生命科学、环
7、境 保护及化学工业的迅速发展,实验动物数量 猛增,3R概念又重新引起人们的关注,许多 国家还为此成立了代替法组织,并参加了代 替法国际会议。在此次会议上,国际委员会 的毒理学家们相继提出了代替传统LD50测 定法的新的急性毒性评价方法,并陆续被官 方所采纳和支持 。 *Free template from 14 替代方法的兴起 1985 年,美国环境保护局(EPA) 不再主张 传统的LD50 试验方法; 1987 年欧洲委员会正式修改过去的急性 毒性试验规范,决定废除现行的LD50 试验 法,规定用固定剂量法来代替LD50 试验法; 1988 年, 美国食品与药物管理局(FDA) 也 签署了相
8、关声明,表示将尽量减少动物用量 ,终止过去的LD50 试验法。 *Free template from 15 替代方法的兴起 1989 年,英国毒理学会提出急性毒性试验 可以不以动物死亡为终点,而是以“表现严 重中毒,如再升高剂量则将会死亡”的效应 作为评价的依据,结果由整个中毒剂量幅度 转变为较低毒性剂量幅度,具有一定的实际 应用价值。 1990 年,日本厚生省也废除了原有严格的 LD50方法,尝试用少量动物,将剂量间隔加 大,来求得大概的致死量范围。 *Free template from 16 替代方法 替代 方法 上下增减计量法 固定剂量法 急性毒性登记法 *Free template
9、 from 17 上下增减剂量法 上下增减剂量法(up and down procedure ,UDP) 是由Dixon 和Mood 等于1985 年利 用优选法提出的LD50推测法,即用少数动 物来推测大概的致死剂量(approximate LD50 ) , 而不要求得到精确的致死剂量。 *Free template from 18 方法 其方法是先设一个剂量试验,根据有无死亡(反应) ,再按等比级数将设计剂量上下移动,一般以1.3 倍级差上升或下降,这样进行510 次试验即可 推定LD50值。试验仅需用510 只动物,且所得 到的LD50 值与传统方法的结果基本相似。目前 FDA、EPA
10、及美国实验材料协会(ASTM) 已接受 其作为标准的试验方法。日本也主张采用大概致 死量,但强调经口致死剂量在300mg/kg 以下的剧 毒物质还应做精确的LD50值测定。 *Free template from 19 固定剂量法 固定剂量法(fixed dose procedure , FDP) 设固定剂量以观察动物的试验反应,不以死 亡为依据,而是按毒性症状来判断受试物质 的毒性。 *Free template from 20 方法 一个试验只需1020 只动物,首先采用1 只动物(多为雌性) 顺次间隔一定时间进行 5、50 、500、2000mg/kg 固定剂量的毒 性测试,如动物出现严
11、重反应时应出于人道 观念处死动物,并利用下一只动物继续较低 剂量的试验,将直至确认出现毒性又无死亡 时的剂量作为可行的正式试验剂量。然后 以此剂量对雄雌动物分别进行观察,结果不 满意则再做另一个剂量。其评价标准为高 毒、有毒、有害、无明显毒性4 类。 *Free template from 21 方法 经济合作与发展组织(OECD) 进一步提出, 如500mg/kg 处理无毒性反应时则再做一 次2000mg/kg的限度试验,仍无毒性反应, 且动物全部存活时即可终止试验。 *Free template from 22 固定剂量法是由英国毒理学会(BTS) 于1984 年 最早提出的,经布鲁塞尔协
12、议后,欧洲委员会曾出 资50 万英镑,由欧洲、日本、美国等地33 个研 究室共同进行了20 个化合物的新旧方法急性试 验,其毒性分级一致率为87.2 % ,结果证实可以用 其代替从1927 年以来一直沿用的LD50 法,而且 可为危险度评价提供较为足够的急性毒性试验资 料,包括中毒作用性质,中毒发生时间、持续时间 和结果等。布鲁塞尔委员会也承认了固定剂量法 的实际应用价值。 *Free template from 23 急性毒性等级法 化学物质的急性毒性是最基本的毒理学依 据。很多毒理学家认为,LD50 值虽然是急 性毒性评价的重要内容,但不必要求其结果 十分精确。在此理念指导下, 产生了急性
13、 毒性等级法( acute toxic classprocedure , ATC) 这种经典的LD50 测试修正方法,由 于它仍是以死亡作为毒性终点,所以仍能提 供粗略的LD50 值。 *Free template from 24 方法 该方法早在1990 年由Sumiey 提出,是一种评估 化学物质急性毒性的简单方法。试验中每性别每 一剂量仅需用3 只动物,首先用2000mg/kg 剂量 处理,如无死亡即可结束试验,无需进一步试验。 如有动物死亡则应采用200 或25mg/kg 剂量继 续试验流程。传统的急性经口毒性试验需用40 只动物,而急性毒性等级法所用大鼠不超过12 只, 因而有效地节
14、省了实验动物用量。用该方法获得 的试验结果同样可用于评价化学物质的急性毒性 及进行毒性分级。 *Free template from 25 结语 中国作为化学物质生产和使用大国,目前急 性经口毒性试验方法的操作主要是依据国 家技术监督局发布的国家标准农药登记 毒理学试验方法和国家环境保护总局发 布的化学品测试方法进行,其中前者主 要采用霍恩氏法,后者主要采用传统的 LD50 值法(霍恩氏法) 、固定剂量法和上 下增减剂量法。 *Free template from 26 结语 国际上对于化学因素对健康危害的预防和控制技 术研究更为重视,目前已制订出一系列限制性的 法律和法规,其中都明确规定了对
15、化学物质的毒 理学安全性评价要求。特别是欧盟委员会为对化 学物质实行统一有效的管理,制订并执行了一套 较为完善的毒理学试验规程,其中急性经口毒性 试验主要采用固定剂量法和急性毒性等级法进行 。近年来,随着动物保护意识的兴起,固定剂量法 、上下增减剂量法、急性毒性等级法等已日益成 为人们关注的毒性试验替代方法。 *Free template from 27 结语 传统的LD50值法(霍恩氏法) 作为经典的急性经 口毒性评价方法虽被使用多年,但它存在许多不 完善的地方。3 种替代方法的特点在于不以获得 精确的LD50数值为核心,不必以死亡作为毒性观 察评价的终点,而更多地关注如何从人性化角度 出发
16、减少试验消耗,简化试验操作过程,保护动物 权益等科学研究的实际应用领域,从而节省了大 量的人力和物力资源,是更为适应信息化、产业 流式化时代要求的良好的科研开发运作方式。但 在评价数据的准确度和精确度方面略逊色于霍恩 氏法。 *Free template from 28 结语 急性经口毒性试验作为毒理学安全性评价最为基础的方 法和试验实施阶段,对于化学物质的毒性评估起着关键的 作用。综合分析国内外的情况,目前在实际研究中对上述 方法的使用还较为含混,所测得的化学物质毒性资料相互 间的可比性不强。因此今后应在有条件的情况下,通过合 理的动物实验设计,运用可靠的数据资料综合比较上述各 方法的优缺点,去粗取精,建立起一整套程序化、规范化 的急性经口毒性实验模式,从而为化学物质急性经口毒性 实验标准的确立和毒性大小的评估提供一个统一量化的 基础和相互沟通交流的平台,同
