《兔病毒性出血症病毒病毒样颗粒的制备及pk13细胞cdna表达型文库的构建》由会员分享，可在线阅读，更多相关《兔病毒性出血症病毒病毒样颗粒的制备及pk13细胞cdna表达型文库的构建（66页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、硕士学位论文 兔出血症病毒样颗粒的制备及R K 13 细 胞c D N A 表达型文库的构建 指导教师姓名、职称 室4 叁溘盟究员 申请学位级别硕士 培养单位 逝江竖整盘堂垡堂鱼生全銎堂堂瞳 论文提交时间2 Q ! Q 生Q 垒旦Q 昼旦论文答辩时间2 Q ! Q 生Q 旦2 Z 旦 学位授予单位与日期 答辩委员会主席 杜爱菱塾援 论文评阅人 2 0 1 0 年0 4 月0 8 日 1 一 P I 辽P A 脚I O NO FV I R U S L I K E P l A R T I C L E SO FR H D V A N DCO N ST R U C T I O NO FT H E E
2、X P R E SS I O Nc D N AL I B R A R YO F R K13C E L L S C a n d i d a t e ：S o n gY i S u p e r v i s o r ：P r o L i uG u a n g q i n g D i s c i p l i n e ：Z o o l o g e C o l l e g eo fC h e m i s t r y & L i f eS c i e n c e ， Z h e ji a n gN o r m a lU n i v e r s i t y , J i n h u a32 10 0 4 M a
3、 y 2 0 10 兔病毒性出血症病毒病毒样颗粒的制备及R K l 3 细胞e D N A 表 达型文库的构建 摘要 兔瘟是对养兔业造成最大危害的一种重要病毒性传染病，具有高度接触性致死性。 其病原体是兔出血症病毒( R a b b i tH e m o r r h a g i cD i s e a s eV i r u s ，R H D V ) ，属于杯状病毒科 ( C a l i c i v i r i d a e ) 兔病毒属( L a g o v i r u s ) 。杯状病毒科病毒具有较广的宿主范围，能引起多 种动物和人类疾病。杯状病毒侵入宿主细胞是病毒进行感染的首要环节，杯状病毒首
4、先 需要与受体结合，之后通过细胞内吞作用进入细胞。关于杯状病毒的细胞受体，目前只 在少数几个种属中获得了一定的进展，但关于R H D V 的细胞受体仍是一片空白。为了 筛选和鉴定R H D V 的细胞受体，我们利用杆状病毒表达系统表达了R H D V 的衣壳蛋白 ( V P 6 0 ) ，纯化获得了病毒样颗粒( V i r u s 1 i k ep a r t i c l e s ，V L P s ) 以及利用S M A R T 方法构建 了R H D V 的宿主细胞_ R K l 3 细胞的e D N A 真核表达文库。 1 R H D VJ X 9 7 分离株V L P s 的制备 以实验
5、室保存的J X 9 7 分离株全长e D N A 分子克隆质粒p B I R H D V 为模板，设计并 合成了覆盖J X 9 7 分离株基因组中v p 6 0 的含酶切位点的引物对，通过P C R 扩增获得 v p 6 0 基因，将基因片段双酶切后分别克隆到杆状病毒表达载体p F a s t B a e l 上。重组质粒 转化D H l 0 B a e 后发生转座，通过“三抗”板和蓝白斑法筛选到阳性克隆后，提取重组 B a e m i dD N A ，转染S f 9 细胞，6 天后收集上清，用上清重新感染新的S f 9 细胞，依次感 染细胞2 次。待S f 9 细胞发生明显病变时，收集上清即
6、为重组杆状病毒，取部分用于检 测或扩大培养。间接免疫荧光和W e s t e r nB l o t 检测结果表明重组蛋白在S f 9 细胞中正确 表达，进一步的电镜观察显示重组病毒感染的S f 9 细胞内以及纯化的重组蛋白都能自我 组装形成V L P s 。 2 R H D VJ X 9 7 分离株宿主细胞R K l 3e D N A 真核表达文库的构建 以兔。肾细胞系R K l 3 为材料提取细胞总R N A ，然后用链霉亲和素磁珠( S A P M P ) 分 离纯化获得m R N A 。利用S M A R T 技术，即以S M A R TI VO l i g o n u e l e o
7、f i d 作为接头，在 3 末端加上一段序列，再利用C D S I I I 3 P C RP r i m e r 尽量将m R N A 全部反转录成 e D N A ，从而获得了全长e D N A 的第1 链，用L D P C R 方法扩增双链e D N A 。经跏I 酶 切后过柱分级收集d se D N A ，选取大片段d se D N A ( 5 0 0b p ) ，核酸沉淀后克隆到聊I 酶切的真核表达载体p E X P L i b 中。最后，利用电转仪1 8K V2 0 0Q2 5 心，电转化至 宿主菌电转感受态细胞( D H 5 a ) 获得了e D N A 文库，通过计算文库的库容
8、量达到 2 5 5 x 1 0 5C F U ，随机挑取1 6 个克隆，用合成的载体上的测序引物P C R 扩增，发现插入 的e D N A 片段大小在4 0 0 - 2 2 5 0b p 之间，插入片段的平均长度约1 0K b 。以上结果表明， 利用R H D V 宿主细胞R K l 3 为材料，构建了一个较高质量的全长c D N A 真核表达文库， 病毒样颗粒； P R E P ARA T I O NO F R U S L I K EP A I 之T I C L E SO FR 皿V A N DC O N S T R U C T I O NO FT H EE X P R E S S I O
9、 Nc D N AL I B R A R Y O FR K l 3C E L L S A b s t r a c t R a b b i th e m o r r h a g i cd i s e a s ev i r u s ( R H D V ；g e n u sL a g o v i r u sf a m i l yC a l i c i v i r i d a e ) i st h e c a u s a t i v ea g e n to fah i g h l yc o n t a g i o u sd i s e a s eo fw i l da n dd o m e s t i
10、 cr a b b i t s C a l i c i v i r u s e sa r e ad i v e r s ev i r u sf a m i l yw i t haw i d er a n g eo fh o s ta n dt i s s u et r o p i s m s T h ef i r s ts t e po fv i r a l i n f e c t i o ni st h eb i n d i n go ft h ev i r u st oc e l l u l a rr e c e p t o r C a l i c i v i r u s e sb i n
11、 dt oh o s tc e l l u l a r r e c e p t o r sa n dt h e ne n t e ri n t oh o s tb ye n d o c y t o s i s Af e wp r o g r e s s e sh a v eb e e nm a d ea b o u tt h e c e l l u l a rr e c e p t o r so fc a l i c i v i r u si ns o m ek i n d so ft h i sf a m i l y , b u tab l a n kt oR H D V T os c r
12、e e n t h ec e l l u l a rr e c e p t o ro fR H D V ，w ee x p r e s s e dt h ec a p s i dp r o t e i no fR H D Vw i t ht h eb a c u l o v i r u s e x p r e s s i o ns y s t e ma n dc o n s t r u c t e dt h ef u l l - l e n g t he D N Al i b r a r yo fR K l 3w i t hS M A R T t e c h n i q u e 1 P r e
13、 p a r a t i o nv i r u s l i k ep a r t i c l e so fR H D VJ X 9 7s t r a i n T h ev p 6 0f r a g m e n tc o n t a i n i n gS a lIa n dH i n dI I Is i t e sw e r es e p a r a t e l ya m p l i f i e db yP C R w i t hp B L R H D Va sat e m p l a t e T h e nt h ev p 6 0g e n ew e r ec l o n e di n t o
14、 p F a s t B a c 1 T h e r e c o m b i n a n tp l a s m i d so b t a i n e dw e r et r a n s f o r m e di n t oD H10 B a ca n dt h ep o s i t i v ec l o n ec o u l d b es c r e e n e di nt h eL Bc u l t u r ep l a t ei n c l u d i n gK a n a m y c i n ，g e n t a m i n c i n ，t e t r a c y c l i n e
15、，X - g a l a n dI P T G T h e nt h er e c o m b i n a n tB a c m i dD N AW a se x t r a c t e da n dt r a n s f e c t e di n t oi n s e c tc e l l S f 9 T h es u p e r n a t a n tw a sc o l l e c t e ds i xd a y sl a t e r A n dt w i c er e p e t i t i v ei n f e c t i o nw a sc a r r i e d o u t 、析
16、t ht h es u p e m a t a n tc o l l e c t e d V P 6 0p r o t e i ne x p r e s s i o nw e r ei d e n t i f i e db yi n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c ea n dW e s t e r nB l o ta s s a y F u r t h e r m o r e ，t h er e s u l t so ft r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p e o b s e r v a t i o ns h o wt h a t e x p r e s s e dp r o t e i n s w e r e c a p a b l e o f s e l f - a s s e m b l i n gt of o r mv i r u s l i k e
