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1、山东中医药大学 硕士学位论文 兔骨髓基质细胞的体外培养及其生物学特性的观察 姓名：许波 申请学位级别：硕士 专业：中医骨伤科学 指导教师：徐展望 20040420 提要 目的建立一种兔骨髓基质细胞体外培养的生物学模型，并对其生物学特性进行 观察和研究。方法抽取新西兰大白兔骨髓液并离心得骨髓单核细胞层，以1X1 0 6 m l 的细胞密度进行接种，置饱和湿度5 C 0 z 培养箱中培养，并逐日在倒置显微镜下进 行观察，记录其贴壁及融合单层时间、形态变化、增殖情况。细胞融合单层并传代后 绘制细胞生长曲线、贴壁率曲线及测定细胞群体倍增时间和细胞活力等。结果原代 培养细胞接种后2 4 3 6 h 后开
2、始贴壁。4 8 7 2 h 时细胞呈集落生长。6 d 时贴壁细胞呈 长梭形外观，部分区域融合成片。1 3 1 6 d 细胞融合单层，成集束状排列。传代细胞 一周左右融合成单层。由细胞生长曲线可以看出，潜伏期 骨膜成骨细胞。骨髓 的成骨能力已在多年前通过骨髓异位移植试验被证实，其成骨能力来源于基质细胞。 将骨髓细胞培养2 4 h 后，可见每个基质细胞可稳定的形成成纤维细胞集落形成单位 ( C F U F s ) ，这些集落是克隆性的，随培养时间的延长而增殖融合成层。将骨髓细胞 装入一种微孔滤膜扩散室( M D C ) 的装置，在植入体内培养，可见有新骨形成，由于 M D C 只允许小分子物质进出
3、，周围组织无法长入，因此可为M D C 内形成的骨细胞是由 骨髓细胞形成的。由于骨髓组织来源丰富，取材方便，并且含有成骨活性较强的定向 骨祖组织，已被证实能转化为成骨细胞。因此，将骨髓抽取物分离后进行体外培养， 建立成骨细胞体外培养模型是可行的。 骨髓可分为造血和基质两大系统，其成骨能力来源于基质系统中的间充质干细 胞。间充质是胚胎早期的结缔组织，间充质细胞是各种结缔组织的干细胞。间充质细 胞( m e s e n c h y m a lc e l l ) 是一种多潜能细胞，分化程度很低，具有未分化细胞的基本 特点。在早期胚胎组织中，间充质细胞的数量较多，动物出生后，结缔组织内仍存在 少量与胚
4、胎间充质细胞相似的多分化潜能细胞，一般称之为间充质干细胞 ( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l ，M S C ) 。M S C 在骨髓基质中较多，而在成年动物的其他结 9 山东中医药大学2 0 0 4 届硕士学住论文 缔组织中，M S C 数量很少且难分离忆利用骨髓基质细胞作为种子细胞的最终着眼点 为诱导其向成骨细胞转化而成骨，而成骨细胞起源于间充质的骨祖细胞或称前成骨细 胞( o s t e o p r o g e n i t o rc e l l ) 。骨祖细胞大致可分为两类：定向骨祖细胞( d e t e r m i n e d o s t e o
5、p r o g e n R o r c e l l ，D o P e ) 和可诱导骨祖细胞( i n d u c i b l e o s t e o p r o g e n i t o r c e l l ，I O P C ) 。在 生理状态下D O P C 为成骨细胞的主要来源，在骨折、脱钙骨基质修复骨缺损等病理 状态下。I O P C 也有很重要的作用。1 9 9 7 年B r u d e r 】等对培养条件下的M S C 的生长增 殖和成骨分化特性进行了全面试验。他们发现这种成人M S c 可以在体外分裂3 8 4 次，并且维持纺锤形态直至细胞衰竭，其成骨潜能直保持到细胞衰竭前，反映出它
6、 们是胚胎期的间充质始祖细胞在体内的存留。许多实验已证实培养的骨髓基质细胞具 备干细胞的两个重要特征：强的自我增殖能力和分化多潜能性。骨髓基质细胞方面 支持骨髓中造血干细胞的生存、生长和分化，另一方面，经许多体外实验证明，可被 诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、成肌腱细胞、成肌细胞或成脂肪细胞等。韩君【8 】 等分离成年大鼠骨髓基质细胞进行培养，用D e x 、A A 、B G P 作骨诱导帮，证实可向成 骨细胞转化，表现为A L P 活性增高和形成钙化沉积。张银刚【9 】等采用胎兔长管骨骨 髓细胞进行体外培养，证明其有骨细胞系特性，可作为修复骨缺损的种子细胞。 L o c k l i n t
7、l 0 1 等研究证明，地塞米松和转化生长因子( T G F 一1 3 ) 抑制骨髓基质细胞增殖但 提高A L P 活性，表明二者可诱导向成骨细胞转化。金丹增在实验中观察到b F G F 可促 进骨髓基质细胞的增殖，V i t C 可促进其分化。骨髓基质细胞有取材方便、机体损伤 小、易于临床应用的特点，适于用作骨组织工程种子细胞的来源。 众所周知，骨髓内主要含有造血和成骨弧类细胞成分，培养过程中如何除去造血 类细胞成分十分重要。因为造血类细胞为悬浮细胞，不贴壁，所以在骨髓体外培养过 程中，随着多次更换培养液，造血类细胞不断被清除，留下的贴壁生长细胞绝大多数 是骨髓基质细胞。镜下观察，贴壁的骨髓
8、基质细胞大多数呈星形，多突起状，细胞之 间借突起相连成网状。 在本实验中，原代培养细胞接种后经过2 4 3 6 h 的滞留期后开始贴壁伸展，7 2 h 后细胞即克隆增殖呈集落生长，2 周后融合单层。传代细胞的滞留期明显缩短，短于 2 4 h ，增殖加快，细胞群体倍增时间约为2 4 h 。l 周左右即融合成单层。传代细胞接种 存活率为9 6 8 。本骨髓基质细胞的体外培养方法得到的细胞生长性状稳定，增殖较 快，呈典型的成纤维细胞样外观，适合甩作骨组织工程学的种子细胞。 1 0 兔骨髓基质细胞的体外培养及其生物学特性的观察 但在实验中我们也发现一些问题，如原代培养细胞接种后的第一次换液时间各家 报
9、道存在很大差异，从2 4 h 7 d 不等。一般来说，贴附生长型细胞生长过程可分为三 个阶段：细胞先进入生长缓慢的滞留期，以后为增殖迅速的指数生长期( 即对数期) ， 最后到达生长停止的平台期。当细胞由活体内接种于体外培养基时，因体外培养基与 体内细胞生存环境不尽相同，故细胞有个对环境的适应过程，此时存活细胞代谢非 常低，经过约为2 4 - 9 6 h 的滞留期后【3 1 ，细胞才贴壁伸展并开始其代谢和运动活动。 所以初次换液的时间太短，可导致大量尚未贴壁的细胞的丢失，而初次换液的时间太 长，又因培养液内营养物质的耗竭而导致细胞的死亡。所以对初次换液时间的掌握十 分重要，通过本次试验，我们发现
10、原代细胞接种后5 d 行初次换液比较合适。 山东中医药大学2 0 0 4 届硕士学位论文 结语 本实验是在参考国内外文献的基础上设计而成，是为下一步的骨髓基质细胞的体 外诱导分化及动物体内实验而做的具有重要意义的前期工作。在本实验中，原代培养 细胞接种后经过2 4 3 6 h 的滞留期后开始贴壁伸展，7 2 h 后细胞即克隆增殖呈集落生 长，2 周后融合单层。传代细胞的滞留期明显缩短，短于2 4 h ，增殖加快，细胞群体倍 增时间约为2 4 h 。l 周左右即融合成单层。传代细胞接种存活率为9 6 8 。实验结果 显示，从细胞的形态变化方面来看，我们所培养的骨髓基质细胞具有典型成纤维细胞 样外
11、观，其生物学特性与大量的文献所报道的也极为相似。可以证明本实验方法所培 养的细胞为骨髓基质细胞，可作为骨髓基质细胞体外培养的生物学模型。 兔骨髓基质细胞的体外培养及其生物学特性的观察 参考文献 1 杨志明组织工程，北京：化学工业出版社，2 0 0 2 第一版：4 4 2 章静波组织和细胞培养技术，北京：人民卫生出版社，2 0 0 2 ，第一版：3 2 3 7 3 司徒镇强，吴正军细胞培养，西安：世界图书出版公司，2 0 0 1 ，第一版：1 7 3 1 8 1 4 胡罢生等，骨组织工程中骨髓基质细胞的定向分化 5 魏宽海，裴国献。组织工程化骨组织中成骨细胞来源的选择国外医学创伤与外 科基本问题
12、分册1 9 9 8 ：1 9 ( 3 ) ；1 5 5 6 杨志明等，不同来源成骨细胞生物学特性的比较研究，中华创伤杂志，2 0 0 1 ：1 7 ( 1 ) 7 B r u d e r S P ，J a i s w a lN ，H a y n e s w o r t hS E G r o w t hk i n e t i C S ，s e l f r e n e w a l ，a n dt h e o s t e o g e n i cp o t e n t i a l o fp u r i f l e dh u m a nm e s e n c h y m a ls t e mc e l
13、l sd u r i n g e x t e n s i v es u b c u l a t i v a t i o na n df o l l o w i n gc r y o p r e s e r v a t i o n J Je e l l B i o c h e m ，1 9 9 7 ，6 4 ( 2 ) ：2 7 8 8 韩君，陈锐，陈槐卿，等大鼠骨髓基质细胞的生长特点和在诱骨条件下的成骨 特性，华西医大学报，2 0 0 1 ；3 2 ( 2 ) ：2 3 5 2 3 9 9 张银刚，杨述华，罗怀灿，等胎兔骨髓基质前成骨细胞的培养及鉴定同济医 科大学学报，2 0 0 0 ；2 9
14、 ( 4 ) ：3 3 1 3 3 3 1 0 L o c k l i nR M ，W i l l i a m s o nM C ，B e r e s f o r dJ Ne ta 1 C 1 i no r t h o p ，1 9 9 5 ：3 1 3 ：2 7 3 5 1 1 金丹，裴国献，等骨髓基质细胞体外培养骨发生潜能及条件研究中国矫形 外科杂志，2 0 0 0 ：7 ( 6 ) ：5 6 5 5 6 8 山东中医药大学2 0 0 4 届硕士学位论文 综述 成骨细胞体外培养的研究进展 组织工程学的发展为修复骨缺损开辟了新的途径。组织工程学是将体外培养的高 浓度的活细胞种植于天然的或人工
15、合成的细胞外基质载体上，然后将它们种植到体内 达到形成新的有功能的组织的目的”。组织工程学的方法修复骨缺损尚处于基础研究 阶段，而成骨细胞的体外培养又是组织工程学的首要环节。早在2 0 世纪6 0 年代，P e c k 和B i r g e 2 】开始用胶原酶消化骨片，体外培养成骨细胞获得成功；1 9 7 5 年W o n g 等【3 】 采用多次胶原酶消化，使培养的成骨细胞得到纯化。1 9 8 5 年，R o b e y 和T e r r a i n 等1 4 采用低c a 2 + 培养液培养骨片获得成骨细胞，经鉴定比酶消化法得到的细胞更加纯化。 此后不少学者又对成骨细胞的培养方法进行了研究
16、和有益的探索的，现就成骨细胞的 研究进展作一介绍。 成骨细胞起源于问充质的骨祖细胞或称前成骨细胞( o s t e o p r o g e n i t o rc e l l ) 。骨祖细 胞大致可分为两类：定向骨祖细胞( d e t e r m i n e do s t e o p r o g e n i t o rc e l l ，D O P C ) 春I 可诱导骨 祖细胞( i n d u c i b l eo s t e o p r o g e n i t o rc e l l ，I O P C ) 。在生理状态下D O P C 为成骨细胞的主要 来源，在骨折、脱钙骨基质修复骨缺损等病理状态下，I O P C 也有很重要的作用。目 前培养成功的成骨细胞大多起源于D O P C 。 一、成骨细胞的来源 ( 一) 骨 国内外文献报道动物( 大鼠、小鼠、鸡、兔) 、人的胚胎颅骨或新生
