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1、 我国血站核酸检测 现状及发展 卫生部临床检验中心 王露楠 血站实验室测定技术的发展 对流免疫电泳试验 反向间接血凝试验 酶联免疫吸附试验（ELISA） 全自动化学发光免疫试验 免疫测定+病毒核酸检测 抗体（抗抗体（抗 原）检测原）检测 病毒抗原病毒抗原 检测检测 病毒核酸病毒核酸 检测检测 血液筛查方法的应用 检测的窗口期不断缩短检测的窗口期不断缩短 抗-HIV HBsAg 抗-HCV HIVp24 抗原 HCV 抗原 抗原抗体联 合检测 NAT HIV-1 RNA HCV RNA HBV DNA 核酸核酸检测方法直接检测病毒的检测方法直接检测病毒的RNA/DNA， 大大缩短了检测的窗口期大
2、大缩短了检测的窗口期 为什么要开展核酸检测 -核酸核酸 P24 抗体抗体 ELISA 0 2 3 4 周周 ( (感染时间感染时间) ) a b 从从a到到b的时间为窗口的时间为窗口期期 病毒血症病毒血症 抗体抗体 无症状无症状 急性急性HIVHIV症状症状 急性感急性感 染期感染期感 染染 年年 血液筛查核酸检测的背景 血站实验室质量管理的发展 2007前前 血站管理办法（暂行）（卫生部令第2号1998） 总体上的经验管理 室内质量控制和室间质量评价 ISO9000认证 2007- 2009 血站管理办法（卫生部令第44号）（2005） 血站质量管理规范卫医发（2006）167号 血站实验室
3、质量管理规范卫医发（2006）183号 血站每年的督导检查，ISO17025认可 2010- 卫生部办公厅关于开展2010年血站核酸检测试点工作的通 知（卫办医政函2010226号）-血站核酸检测试点 核酸检测试点单位数及检测量 2010年：15家试点单位，64.2万人份，占年献血人次 的6.3%。 2011年：共21家血站（16个省市自治区）检测166.6 万人份占年献血人次的14.7%。 2012年：有31家血站（19个省市自治区）共检测 256.8万人份，占年献血人次的20.6%。 2013年：61家血站（25个省市自治区）共检测411.7 万人份，占年献血人次的32.0%。 3年年7个
4、月累计进行核酸检测个月累计进行核酸检测899.3万人份。万人份。 我国核酸检测的进展情况 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 2010年 2011年 2012年 2013年 64.2 166.6 256.8 411.6 1030 1133 1247 1288 2010-2013年核酸检测进展年核酸检测进展 核酸检测数量（万人份）核酸检测数量（万人份） 总检测数量（万人份）总检测数量（万人份） 亚太地区血液核酸检测 经血传播疾病的风险 一般人群一般人群HBsAgHBsAg阳性率阳性率7.18%7.18% 我国现有的慢性我国现有的慢性HBVHBV感染者约感染者约930
5、09300万人；万人； 人口流动增加人口流动增加 乙型肝炎的各种治疗药物治疗方法导致乙型肝炎的各种治疗药物治疗方法导致HBVHBV变异株变异株 和和隐匿性乙型肝炎感染者隐匿性乙型肝炎感染者成为血液安全的威胁成为血液安全的威胁 HCVHCV感染者感染者0.43%0.43% 估计存活估计存活HIVHIV感染者感染者7878万万 少数高危人群献血比例较高少数高危人群献血比例较高 上海上海 100%100% 青海青海 西藏西藏 天津天津 99.5%99.5% 山东山东29.6%29.6% 北京北京87.8% 辽宁辽宁 39.8% 海南海南100100% % 吉林吉林56.2%56.2% 黑龙江黑龙江
6、湖北湖北21.6%21.6% 湖南湖南4.4%4.4% 河南河南17.3%17.3% 广西广西7.3% 陕西陕西 49.5%49.5% 宁夏宁夏 四川四川 21.6% 贵州贵州 5.8% 新疆新疆 12.2% 云南云南 32.6% 西藏西藏 核酸检测工作实施方案 我们需要的不仅仅是酶免疫检测我们需要的不仅仅是酶免疫检测 核酸检测不仅仅 是检测策略问题 影响核酸检测推进的因素 技术问题技术问题 实验室、设备、试剂、实验室、设备、试剂、人员人员 血站核酸检测实验室管理办法血站核酸检测实验室管理办法 全国血站核酸检测技术指导意见全国血站核酸检测技术指导意见 技术培训技术培训 影响核酸检测推进的因素
7、资金问题资金问题 一次性投入：实验室改造、设备购置一次性投入：实验室改造、设备购置 2010年年2010年血站核酸检测项目年血站核酸检测项目 管理方案管理方案，投入，投入1.65亿亿 持续的投入：按照平均检测成本（持续的投入：按照平均检测成本（60元元/人份），人份）， 全年献血全年献血1260万人次计算，全国需投入万人次计算，全国需投入7.6亿元。亿元。 影响核酸检测推进的因素 集中化检测问题集中化检测问题 2006年即提出集中化检测模式年即提出集中化检测模式 分级财政的问题使得集中化检测难以实现分级财政的问题使得集中化检测难以实现 解决措施解决措施 ？分级财政分级财政中央财政统一拨款中央财
8、政统一拨款 ？统一检测，检测费用由财政统一支出统一检测，检测费用由财政统一支出 ？调整血价调整血价 提得最多的其他问题 检测费用 集中检测的协调 “试点”的含义 一个需要改变原来工作流程不同的新的领域 一个发现问题解决问题的过程 一个取得经验的过程 一个求证的过程 一个获得最佳流程的过程 血站核酸扩增检测国内目前所用的试 剂及方法特点 上海科华上海科华 上海浩源上海浩源 中山达安中山达安 ROCHE （Cobas TaqScreen MPX Test） Chiron （Procleix Ultrio TM Assay） 方法 实时荧光 PCR 实时荧光 PCR 实时荧光 PCR 多重实时荧 光
9、PCR TMA 内标 有 有 有 有 有 HBV、HCV、 HIV检测模式 各指标分管 检测 一管内多重 PCR，但直 接检测三项 指标。 各指标分管 检测 一管内多重 PCR，不能 区分是何指 标 一管内联合 检测先不区 分，反应性 样本再行单 个指标检测 检测系统的 组成 HAMILTON 混样仪、提 取仪、实时 荧光PCR仪 HAMILTON 混样仪、提 取仪、实时 荧光PCR仪 混样仪、提 取仪、实时 荧光PCR仪 HAMILTON Microlab STAR IVD Pipettor混样 仪、COBAS AmpliPrep Instrument全自动核酸 提取仪、COBAS TaqM
10、an Analyzer和the Pooling and Data Management (PDM) Software TECAN混样仪 （如混合样本）、 TMA检测仪（一 管内完成提取、 扩增及杂交发光 检测） 我国血站NAT试点给我们带来了什么？ 证明了我国血站NAT的必要性 初步形成了我国血站NAT及其质量保证（标本 采集等、室内质控和室间质评）的模式和方法 探索了我国血站NAT人员培训的模式和方法 血站对NAT逐步增强了自信 实验室人员的质量意识进一步得到了加强 展望 新的血站技术操作规程（卫医政发20121号附 件）：一遍ELISA，一遍NAT。 全面推进血站核酸检测工作实施方案（20
11、13-2015 年）（卫计生发201322号）：到2015年，血液筛 查核酸检测基本覆盖全国。 2013年，东部60%（省会70%）、北京上海80%、中部 50%、西部30%（省会40%）以上。以后基本是每年增加 10%。 工作任务之一，是加强质量管理和控制。 整体提高血站实验室管理水平。 2010年6月-2013年12月血液筛查 核酸检测数量 仅占同期检测 量的19.1% 超过80%的血液存 在传播 HIV/HCV/HBV的 风险！ 实验室检测策略 采血前初筛 ELISA检测 核酸检测 样本的进一步验证、确认及献血 者随访 HBV DNA -HBsAg 酶免检测的结果评估 酶免检测的不可替代
12、性 核酸检测是否存在假阳性或假阴性 联检阳性率 鉴别阳性率 与血清学指标的相关性 HBV DNA阳性-多数源于隐匿性感染 肝脏有HBV DNA复制且血清中未检测到 HBsAg 有别于窗口期 一般都为HBcAb阳性（50%HBsAb也为阳 性） 很少一部分为单独HBsAb阳性 没有抗体的初期隐匿性感染 HBV DNA试剂的状况试剂的状况 Ultrio 鉴别鉴别 MPX, v2.0MPX, v2.0 MPX (v1) PIMPX (v1) PI 浩源浩源 科华科华 HBV 10.44IU/ml10.44IU/ml 8.52IU/ml8.52IU/ml 2.4IU/ml2.4IU/ml 3.8IU/
13、ml3.8IU/ml 6.3IU/ml6.3IU/ml 5IU/ml5IU/ml HBV DNA-HBsAg HBV NAT 无疑为血液安全提供了更好地保障 血清学检测 和NAT 互补，不可互相替代 依然有可能漏检 导致OBI产生是多原因的，情况各不同 造成输血后感染的危险 窗口期 anti-HBc OBI anti-HBs OBI 疫苗的作用与基因型有关？ 慎重调整抗原抗体的检测试剂 HBsAg漏检，特别是低值或变异株漏检，往往是sAg-eAb-cAb或 sAb-cAb血清学模式，这类模式往往HBV DNA含量很低，甚至 5IU/ml，目前核酸检测水不可能达到100%检出。 核酸检测试剂问题
14、 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 36 38 40 42 44 46 48 50 阳性预期值阳性预期值 ct值值 阳性预期值阳性预期值 江西 全国 青岛 2 12 22 32 42 52 62 72 82 92 36 38 40 42 44 46 48 50 阴性预期值阴性预期值 ct值值 阴性预期值阴性预期值 江西 全国 青岛 抗HCV与HCV RNA 抗HCV酶免单试剂阳性的结果 641,482 样本总样本总 数数 复检所用复检所用 试剂结果试剂结果 为阴性为阴性 复检出现复检出现1 家或以上试家或以上试 剂阳性剂阳性 确认结果确认结果 阴性 不确定
15、 阳性 1028 204 824 138 635 51 1.60 0.32 1.28 0.22 0.99 0.08 抗HCV阳性 HCV RNA阴性 0 50 100 150 200 250 300 350 400 1.01-5.00 5.01-8.0 8.01-20 20 HCV RNA阳性和阴性的样本阳性和阴性的样本的的化学发光检测结果化学发光检测结果S/Co 分布分布 RNA阳性总数 RNA阴性总数 试剂的状况试剂的状况 Ultrio 鉴别鉴别 MPX, v2.0MPX, v2.0 MPX (v1) MPX (v1) PI PI 浩源浩源 科华科华 HCV 3.01/ml3.01/ml 3.17IU/ml3.17IU/ml 7.1IU/ml7.1IU/ml 11.0IU/ml11.0IU/ml 23.3IU/ml23.3IU/ml 50IU/ml50IU/ml 抗HCV与HCV RNA 抗HCV漏检：当抗HCV为阳性时，HCV RNA 不一定为阳性，而低值抗HCV虽然HCV RNA 阳性比例低，但往往这部分样本的HCV RNA含 量并不高。 核酸检测灵明度高，但仍有可能漏检。 关于HIV MSM献血员是各国都面对的问题 几乎100% 试剂的状况试剂的状
