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1、荧光定量荧光定量PCR技术在 临床诊断中的应用 技术在 临床诊断中的应用 中山大学临床检验标准化研究中心 主任 中山大学 中山医学院生物化学教研室教授 朱振宇医学博士、教授、博士生导师 Tel：13922430138，02037656430 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 1998年荧光定量PCR技术开始在中国应用 于临床检测 PCR 发展简史发展简史 PCR (Polymerase Chain Reaction) 1983 Cetus 公司的 Kary Mullis于12月16日第一 次成功 实验发明了PCR 1985 关于PCR 的文章首次由 Kary Mullis及其同事等人
2、在Science上 发 表 1989 12月Science杂志将PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry 1995 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量PCR技术 循环次数循环次数DNA的链数的链数 1 212 2 224 3 238 10 2101024 20 2201,048,576 30 2301,073,741,824 10亿亿 PCR循环次数与循环次数与DNA产量关系产量关系 PCR循环 PCR特点：高效扩增、忠实复制特点：高效扩增、忠实复制 灵敏度高灵敏度高 快捷快捷
3、 简便简便 对样品纯度要求低对样品纯度要求低 可以相对定量可以相对定量 PCR反应的特点 Ct值的意义 Ct值与重复性 同一样本在相同条件下同时进行 值与重复性 同一样本在相同条件下同时进行96次 扩增 次 扩增 Ct值与浓度 不同的模板达到荧光域值时的 值与浓度 不同的模板达到荧光域值时的Ct 值不同值不同 FQ-PCR ? ?感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断 ? ?母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察 ? ?遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 ? ?肿瘤的诊断肿瘤的诊断肿瘤的诊断肿瘤的诊断 ?
4、 ?法医学鉴定法医学鉴定法医学鉴定法医学鉴定 荧光定量荧光定量PCR的临床应用的临床应用 ? ?早期诊断早期诊断早期诊断早期诊断 （超早期诊断）（超早期诊断）（超早期诊断）（超早期诊断） ? ?病情评估和预后判断病情评估和预后判断病情评估和预后判断病情评估和预后判断 ? ?抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导 ? ?新药验证新药验证新药验证新药验证 一感染性疾病 1. 病原体含量与病情之间的关系 2. 病原体含量与用药之间的关系 3. 药物及疗法的研究与开发 4. 新的病原体分子诊断标准 5. 新的愈后指标 6. 传染病发病的
5、监控、预测与预防 临床应用 临床应用 二肿瘤(HPV-宫颈癌；EBV-鼻咽癌；HP-胃癌) 1. 肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞 因子、受体等 2. 肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿 瘤转移基因及转移抑制基因 三 遗传病 （a、b-地中海贫血、唐氏综合症、性别连锁遗传病地中海贫血、唐氏综合症、性别连锁遗传病） 1. 等位基因检测 2. 多基因遗传病的突变检测 3. 基因表达异常所致遗传病检测 荧光定量PCR在病原体检测中的应用 一肝炎病毒定量检测 二性病病原体检测 三 结核杆菌及呼吸道病原体检测 四 优生优育(TORCH)相关项目检测 临床应用 一肝炎病毒定量检测
6、 HBV HCV 临床应用 （一） 乙型肝炎病毒结构及特点 HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体 HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内， 一般不存在于血循环中 HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM 提示HBV处于复制状态 HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良 好 HBV HBV （二） HBV-DNA与“两对半” 1. 1. “ “两对半两对半” ” ：机体的免疫反应状态；：机体的免疫反应状态； 2. 2. “ “携带者携带者” ”、“ “大三阳大三阳” ”、“ “小三阳小三阳” ”等免疫学指标不能等免疫学指标不能 反应体内
7、病毒复制水平与感染程度。反应体内病毒复制水平与感染程度。 FQFQ- -PCRPCR：检测的是：检测的是HBVHBV本身的遗传物质本身的遗传物质DNADNA，是，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。 3. 血清学指标()不能排除HBV感染。 HBV （二） HBV-DNA与“两对半” HBsAg() HBV-DNA() HBeAg () HBV-DNA() 4. 4. 也可能出现也可能出现HBsAg(HBsAg() )，HBVHBV- -DNA(DNA() )。 5. HBsAb (5. HBsAb () ) 、 HBcAb (HBcAb () )
8、、 HBeAb (HBeAb () )三抗体阳性三抗体阳性 与与HBV DNA 2.5HBV DNA 2.5 103copy /ml /ml 结果解释。结果解释。 HBV (三)HBV-DNA定量检测的临床意义 1. HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性 3. HBV-DNA定量与预后 a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 b. 癌变的几率明显高于含量低者 2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效 a. 专家提出103copy /ml做为阴性或临床治愈标准 b. HBV-DNA定量分析与干扰素干扰素治疗(前、中、后) c. 拉咪呋啶拉咪呋啶 HBV感染与干扰素治疗 治疗前： a: 治疗前HB
9、V低水平复制者对干扰素的反应性明 显优于高水平复制者。 b: 治疗前HBV DNA 含量特别高者大多没有疗效。 c: HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清HBV DNA 含量较低者。 HBV感染与干扰素治疗 治疗中： a: a: 病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。 b: b: 相反，治疗期间HBV DNA复制水平下降较慢， 或下降幅度较小，或者变化不明显者，大多是 干扰素治疗无效。 HBV感染与干扰素治疗 治疗后： a: 治疗结束后，采用PCR定量法检测，HBV DNA 103copy/ml 者，可能不再复发。 b: 终止治疗后HBV DNA 仍保持较低水平者， 反跳的可能性较大。 ALT
10、Months after Start of Therapy 0 Normal Alt 治疗前治疗前 1234561224 HBV DNA HBe Ag HBs Ag Poor Response to IFN TherapyPoor Response to IFN Therapy CHRONIC HEPATITIS BCHRONIC HEPATITIS B 拉咪呋啶：拉咪呋啶： 有显著降低高病毒载量作用，近期疗效 颇有优势，但是长期使用可导致HBV变 异，患者易出现耐受性，而且容易出现 停药后反弹。 HBV感染与拉咪呋啶拉咪呋啶治疗 0 -20 -40 -60 -80 -100 治疗周数 拉米夫
11、定 安慰剂 血清HBV DNA; 中位%变化 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 n=192 n=404 n=171 n=359 拉米夫定抑制血清拉米夫定抑制血清拉米夫定抑制血清拉米夫定抑制血清HBV DNAHBV DNA HBV (三)HBV-DNA定量检测的临床意义 4. HBV-DNA定量有助于指导怀孕与孕期，哺乳期检查 5. 肝脏移植与HBV-DNA Mazzaferro等报告：105copy /ml 发生了严重HBV再感染 6. 血液制品和献血员的筛选 病毒特点： 1. 单正链RNA病毒 2. E1和E2区基因高度变异性 （一）丙型肝炎病毒特
12、点 感染特点： 1. HCV在血中含量极微 2. 输血后肝炎主要致病因子 3. 免疫学标志仅有抗-HCV，非中和抗体，产生时间不一 4. 有一部分人感染HCV后，不产生抗-HCV 5. 感染易于慢性化(50-85%) 6. 疫苗研制尚不成功 HCV 单链RNA (二)HCV-RNA定量检测的临床意义 1. 早期诊断 a. 临床以 80 copy/ml做为无感染或治愈标准。 b. HCV感染1-3W，即可检出HCV-RNA的存在。 c. 严格筛选献血员 ,提高对窗口期感染者的检出率。 d. 医疗纠纷中的“举证倒置”，病人入院前后进行HCV-RNA 检测。 HCV HCV (二)HCV-RNA定量
13、检测的临床意义 2. HCV-RNA载量与抗-HCV滴度、ALT水平之间的相关性。 抗-HCV滴度和ALT异常率随着HCV-RNA载量升高而增加。 3. HCV-RNA是评价抗病毒治疗效果的重要指标。 4. 慢性丙型肝炎长期抗-HCV阳性，这时如果进行HCV-RNA 定量检测可以鉴别活动性、复制程度。 二常见性传播疾病病原体 一淋球菌（NGH） 二沙眼衣原体（ CT ） 三解脲脲原体（UU） 四梅毒螺旋体（TP） 五单纯庖疹病毒（HSV） 六乳头瘤病毒（HPV） 七人类免疫缺陷病毒（HIV） 八EV71 A16 通用型 STD 艾滋病艾滋病 艾滋病是英文艾滋病是英文AIDS（Acquired
14、Immunity Deficiency Syndrome) 的中文译音，全称是的中文译音，全称是“获得性免疫缺陷综合 征 获得性免疫缺陷综合 征”。它可以由人类免疫缺陷病毒（。它可以由人类免疫缺陷病毒（HIV,Human-being Immunity Deficiency Virus ），又称艾滋病病毒引起的疾 病。当病毒侵入人体后，经一段时间的潜伏期，破坏人体的 免疫力，从而发病，病死率高，是一种严重的传染病。 ），又称艾滋病病毒引起的疾 病。当病毒侵入人体后，经一段时间的潜伏期，破坏人体的 免疫力，从而发病，病死率高，是一种严重的传染病。 艾滋病是一种有明确病原体的可通过人之间一定传 播途
15、径传播的慢性传染病，属于传染病防治法 中规定的乙类传染病 艾滋病是一种有明确病原体的可通过人之间一定传 播途径传播的慢性传染病，属于传染病防治法 中规定的乙类传染病 HIV病毒：多亚型和多变异 HIV-1和和HIV-2 M组、组、O组和组和N组组 亚性型：亚性型：A-K CRF：基因重组亚型，主要是：基因重组亚型，主要是HIV-1型型 毒株亚型监测的意义毒株亚型监测的意义 不同亚型与不同传播途径的关系：不同亚型与不同传播途径的关系：B主要通过男性同性性行 为和静脉注射吸毒传播， 主要通过男性同性性行 为和静脉注射吸毒传播，C主要异性性接触传播主要异性性接触传播 流行地理和传播线路的分析：东南亚
16、区域的流行地理和传播线路的分析：东南亚区域的C亚型和亚型和B亚型亚型 重组亚型传播效力变化及对流行的影响：东欧的重组亚型传播效力变化及对流行的影响：东欧的B/A重组流 行、泰国的 重组流 行、泰国的A/E重组重组 艾滋病病毒在外界的抵抗力 HIV病毒一旦离开宿主细胞在外界环境中生存能力很 快消失 病毒一旦离开宿主细胞在外界环境中生存能力很 快消失 HIV对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱， 比乙型肝炎病毒（ 对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱， 比乙型肝炎病毒（HBV）的抵抗力低得多）的抵抗力低得多 对对HBV有效得消毒和灭活方法均适用于有效得消毒和灭活方法均适用于HIV 典型进展者：典型进展者：8-10年潜伏期后成为艾滋病人，年潜伏期后成为艾滋病人，80% - 90% 快速进展者：快速进展者：CD4细胞细胞2-5年内迅速下降，年内迅速下降，HIV病毒载 量一直维持较高水平，而且分离的 病毒载 量一直维持较高水平，而且分离的HIV有均
