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1、分类号 U D C 密级 编号 十- 初大- 擎 C E N T R A LS o U T HU N I V E R S I T Y 硕士学位。论文 论文题目： 学科专业： 研究 生： 导师姓名及 专业技术职称： 中南大学 二O 一一年五月 一 一 一 分类号U D C 硕士学位论文 密级 舢l I I | I | | f I f 川f f | I f | | l I I I f f f f I I I 舢 Y 1917 3 0 8 光敏剂5 氨基酮戊酸对强脉冲光嫩肤治疗的影响 E f f e c t so f5 一A m i I l o l e v u l i n i ca c i di 1
2、 1t h eP h o t o ( 1 y n a m i c P h o t o r e j u V e n a t i o nT h e r a p yo f I n t e n s eP u l s e dL i g h t 论文答辩日期 研究生：罗翔 学科专业：皮肤病与性病学 学院：湘雅三医院 导师：黄进华教授 竺! ! ：竺：!答辩委员会主席 中南大学 二O 一一年五月 海k 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大
3、学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：! 翌趟 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 硕士学位论文 中文摘要 摘要 目的 评价光敏剂5 氨基酮戊酸( A L A ) 对强脉冲光( I P L )
4、嫩肤效果 的影响，并探索A L A 对光子嫩肤治疗效果影响的可能机制及潜在风 险，为光动力( P D T ) 嫩肤术在美容皮肤科领域的应用提供实验室证 据参考及理论指导。 方法 将8 0 只5 月龄的雌性昆明种小鼠随机分为4 组：阴性对照组， A L A 组，I P L 照射组，A L A + I P L 照射组( 每组2 0 只) 。硫化钠脱毛 后分别予以相应处理，并在处理后O 2 8 天内的5 个不同时间点观察 各组小鼠皮肤大体形态、镜下皮肤组织结构、I 、I I I 型胶原、弹力胶 原纤维、转化生长因子B ( T G F B ) 的变化，进行对比统计分析并 寻找其相关性。 结果 1 A
5、L A + I P L 照射组最小红斑剂量较I P L 照射组明显降低 ( 尸 4 5 h 不能恢复知觉或麻 醉后直接死亡，在正式实验中均得到严格避免。 2 2 1 5 光敏剂A L A 的使用 配置好的A L A4 度冰箱避光保存，在3 h 内完成使用，涂抹好A L A 的小鼠 放入暗盒严格避光，2 h 后予以口L 照射。参考临床使用剂量，每只小鼠A L A 的使用量定为1 5 I n g ，使用面积约5 锄2 ( 即m L 光照区域，详见章节2 2 1 6 ) 。 为保证光敏剂U A 涂抹均匀，并在涂抹部位保持2 h 不被擦除，涂抹A L A 前需 先行小鼠麻醉。无A I A 处理小鼠也予
6、以同时麻醉，2 h 予以照光( 或不照光) ， 以确保处理因素的一致性。 2 2 1 6I P L 照射 麻醉状态的脱毛小鼠在涂抹或未涂抹舭A2 h 后予以强脉冲光照射( 对照组 仅涂抹冷凝胶，不予照射) 采用临床常用P L 嫩肤治疗参数：口L 光源采用了5 6 0 衄 的滤光片过滤，三脉宽2 6 m s 、4 2 I 璐、3 6 m s ，延时3 0 m s 、4 0 I l 鸲。通过预实验最 小红斑量测试，最后确定的照射能量密度为2 0 J 伽? 。 治疗前小鼠皮肤涂抹了冷凝胶保护避免灼伤，但为防止小鼠麻醉状态下体温 过低导致死亡，治疗后无冷敷处理，同时统一更换饲养笼的垫料，避免环境潮湿
7、阴凉导致小鼠复温困难。m L 光照区域选择：以小鼠背部脊柱隆起最高点为参照 点作水平线，往尾端平移l c m 作另一平行线，两者之间的区域为照光区，治疗 6 硕士学位论文 第二章材料和方法 时非光照部位均以纱布覆盖。 2 2 1 7 标本取材 分别在I P L 治疗后第l 、3 、7 、1 4 、2 8 天每组每次分别随机取l 笼小鼠( 4 只) ； 于照射部位及非照射部位( 对照) 切取皮肤样本：脊柱两侧皮肤分别取材，组织 块修剪为大小约7 m m 1 0 l 啪2 m m ，每组共取标本8 块，以4 多聚甲醛固定液固 定2 4 h ，转移至O O l 叠氮化钠保存液中保存，5 期标本全部收
8、齐后统一进行脱水 包埋处理。 2 2 1 8 标本处理 脱水包埋：适当修剪组织，室温脱水( 蒸馏水漂洗2 5 m i n ，5 0 乙醇3 0 m i n ， 7 0 乙醇1 h ，9 5 乙醇3 0 m i n 一4 5 m i n2 次、1 0 0 乙醇3 0 m i n 一4 5 m i n2 次，l o o 乙醇 异丁醇( 1 ：1 配置) 1 h ，1 0 0 9 6 异丁醇4 过夜( 1 2 h ) ，1 0 0 正丁醇1 2 h ；浸蜡：石 蜡I ( 熔点5 6 ) 1 h 1 5 h ，石蜡I I ( 熔点5 8 ) l h 1 5 h ，包埋，修块后4 保存。 石蜡切片制备：
9、切片前蜡块在一2 0 冰箱预冷3 0 m i n ，常规石蜡切片片厚 3 岬，免疫组织化学染色切片片厚7 岬，连续切片。放入4 5 蒸馏水中使石蜡切 片充分展开；捞片、贴片，烤片仪3 7 烤干l h ，为防止掉片，烤好的切片继续 置于3 7 烤箱过夜( 1 2 一1 8 h ) ，制好的切片入4 冰箱保存备用。 2 2 2 切片染色 2 2 2 1H E 染色 ( 1 ) 脱蜡：切片放入5 7 恒温箱3 0 m i n ，后依次置入二甲苯I ( 1 0 0 9 6 ) 内 浸泡5 m i n ，二甲苯I l ( 1 0 0 9 6 ) 内浸泡5 m i n ，二甲苯I I I ( 1 0 0
10、) 内浸泡5 m i n ，1 0 0 酒精I 内浸泡5 m i n ，1 0 0 酒精I I 内浸泡5 m i n ，1 0 0 9 6 酒精I I l 内浸泡5 m i n ，9 5 酒 精I5 m i n ，9 5 酒精I I5 m i n ，8 0 酒精3 m i n ，7 0 酒精3 m i n ( 2 ) 水化：蒸馏水浸泡1 0 m i n ( 3 ) H a r r i s 苏木素液1 5 m i I l ( 4 ) 自来水返蓝1 5 m i I l ( 5 ) 0 5 盐酸乙醇分化l O 3 0 s ( 6 ) 伊红复染1 m i n ( 7 ) 9 5 酒精l O s ( 8
11、 ) 酒精梯度脱水：置入7 0 乙醇5m i n 、8 0 乙醇5m i n 、9 5 乙醇I5m i n 、 9 5 乙醇n5m i n 、1 0 0 乙醇I5m i n 、1 0 0 乙醇I I5m i n 7 硕士学位论文第二章材料和方法 ( 9 ) 二甲苯透明：二甲苯I5m i n 、二甲苯5m i n ( 1 0 ) 中性树胶封片 结果判定：细胞核被苏木精染成蓝色，胞浆、肌纤维、胶原纤维、红细胞被 伊红染成不同程度的红色。 2 2 2 2 免疫组织化学染色 ( 1 ) 脱蜡：切片放入5 7 恒温箱3 0 m i n ，后依次置入二甲苯I ( 1 0 0 9 6 ) 内 浸泡5 m i
12、 n ，二甲苯I I ( 1 0 0 ) 内浸泡5 m i n ，二甲苯I ( 1 0 0 ) 内浸泡5 m i n ，1 0 0 酒精I 内浸泡5 m i n ，1 0 0 酒精I I 内浸泡5 m i n ，1 0 0 9 6 酒精I I I 内浸泡5 m i n ，9 5 酒 精I5 m i n ，9 5 酒精I I5 m i n ，8 0 酒精3 m i n ，7 0 酒精3 m i n ( 2 ) 水化：蒸馏水浸泡1 0 m i n ( 3 ) 抗原热修复：将切片浸入含1 U n 腿s k i n ga g e n t 抗原修复液，8 5 恒温水浴箱孵育2 5 m i n ，冷却后O
13、 0 1 MP B S 漂洗2 次，每次5 m i n 。 ( 4 ) 3 H 。0 2 室温孵育5 m i n ，以灭活内源性过氧化物酶活性，0 0 1 MP B S 洗 2 次，每次5 m i n 。 ( 5 ) 滴加封闭液，每片2 0 0 p l ，室温孵育6 0 分钟。倒去多余液体，不洗。 ( 6 ) 滴加一抗( 各检测指标稀释倍数为：C O L Il ：4 5 0 ，C O L I I l1 ：3 0 0 ， T G F B1 ：3 0 0 ) ，每片1 5 0 “l ，过夜( 大于1 4 h ) 。 ( 7 ) P B S 冲洗3 次，每次1 0 m i n 。 ( 8 ) 去除P
14、 B S 液，加相应二抗，每片1 5 0 肛l ，室温下孵育2 h ，随后P B S 冲 洗三次，每次1 0 m i n 。 ( 9 ) 去除P B s 液，滴加生物素卵白素每片1 5 0 I l l ，室温下孵育2 h ( 注：生 物素卵白素提前配制，静置1 h 以上后使用) ，随后P B S 冲洗3 次，每次l O m i n 。 ( 1 0 ) D A B 显色：使用D A B 显色试剂盒，取2 5 m l 蒸馏水，加试剂盒中B u f f e r O 1 m l 、D A BO 1 m l 、过氧化氢O 0 5 m 1 ，混匀后滴加，每片2 5 0 p 1 ，室温显色，镜 下控制显色时
15、间，P B S 洗涤，终止反应后继续P B s 浸泡大于3 0 m i n 。 ( 1 1 ) 酒精梯度脱水：置入7 0 乙醇5m i n 、8 0 乙醇5m i n 、9 5 乙醇I5m i n 、 9 5 乙醇I I5m i n 、1 0 0 9 6 乙醇I5m i n 、1 0 0 乙醇I I5m i n ( 1 2 ) 二甲苯透明：二甲苯I5m i n 、二甲苯1 1 5m i n ( 1 3 ) 中性树胶封片 结果判定：统计指标包括厚度、百分比、累积光密度。 2 2 2 3 弹力纤维染色 采用采用福建迈新弹力纤维染色试剂盒染色，过程如下： ( 1 ) 脱蜡：切片放入5 7 恒温箱3
16、0 n I i n ，后依次置入二甲苯I ( 1 0 0 ) 内 8 硕十学位论文第二章材料和方法 浸泡5 m i n ，二甲苯I I ( 1 0 0 ) 内浸泡5 m i n ，二甲苯I I I ( 1 0 0 ) 内浸泡5 m i n ，1 0 0 酒精I 内浸泡5 m i n ，1 0 0 酒精l I 内浸泡5 m i n ，1 0 0 酒精I I I 内浸泡5 m i n ，9 5 酒 精I5 m i n ，9 5 酒精I I5 m i n ，8 0 酒精3 m i n ，7 0 酒精3 m i n ( 2 ) 水化：蒸馏水浸泡1 0 m i n ( 3 ) 滴加L u 9 0 l 碘液，孵育5 m i n ，稍水洗 ( 4 ) 滴加硫代硫酸钠，处理5 m i n ( 5 ) 流水冲洗5 m i n
