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1、Neon-细胞电转仪中文说明书(MPK) 作者： 日期：14 一，简单的3步骤程序。1.将收集到的细胞和待转染的分子（例如DNA，RNA，siRNA）的混合物加入到提取物中。2.将带专用枪头的移液器插入带有电极杯的移液器座中; 在设备上选择程序，然后按开始。3.拔下移液器，将转染的细胞转移到含有适当培养基的培养容器中。注：1. 为了避免污染，强烈建议只使用电极杯10次。建议在切换到不同质粒DNA / siRNA或细胞类型时更换电极杯和缓冲液2. 为了确保重复性和排除转染条件的变化，建议不要使用枪头超过2次二，软件操作程序1.按下电源开关（位于设备背面，第vii页）打开Neon设备。 本机检查确
2、保Neon移液器站已连接到设备，然后显示启动屏幕。2.按Voltage启动数字键盘输入电压值。 按所需的电压值，然后按Done保存该值。 注意：如果任何输入值超出限制，则会显示错误信息，并自动设置最小的限制值。3.按Width激活数字键盘输入宽度值。 按所需的宽度值，然后按Done保存该值。4. 按Pulses激活数字键盘以输入脉冲值。 按所需的脉冲值，然后按Done保存该值。5. 如果要保存这些电穿孔参数，请按主屏幕上的“Save”将程序保存在数据库中。6. 按所需的程序号码编辑程序。 选定的程序会突出显示。7. 显示“Edit”屏幕后，按键盘按钮输入用户名。 光标自动移动到下一个字段协议，
3、并突出显示为红色。继续输入Voltage，Width和Pulses信息。8。按Enter键将信息保存在数据库中。9. 继续准备细胞和DNA，并设置用于电穿孔的移液器座三，细胞与DNA混合物准备注意事项：1. 将纯化的DNA重悬于1-5g/L浓度的去离子水或TE缓冲液（10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH8.0）中。 浓度可能因细胞类型而异。2. DNA量不应超过使用总体积的10。3. 通过测量A 260/280比例来检查纯化的DNA制剂的纯度。 电穿孔的比例应至少为1.8。4. 该装置已经用4-7kb质粒进行常规测试，质粒高达约20kb不应该是问题。 使用大于20 kb的质粒很可能
4、降低转染效率。5. 不要用乙醇沉淀DNA以浓缩DNA。 通过乙醇沉淀的浓缩DNA显示差的转染效率和由于盐污染导致的细胞活力。6. 不含Ca2 +和Mg2 +的D-PBS或磷酸盐缓冲盐水（PBS）（第40页）流程：1. 用3 mL电解缓冲液（使用缓冲液E，10LNeonTip和Buffer E2，100LNeonTip）填充电转杯。（确保管子侧的电极完全浸入缓冲液中。）2. 将电极杯插入移液器座，直到听到咔嗒声。确保Neon管的侧面电极与Neon移液器站的侧球柱塞良好连接（见下图左侧正确位置）3. 在电穿孔前一天，将细胞转移到具有新鲜生长培养基的培养瓶中，使得细胞在实验当天为70-90汇合。4.
5、 对于大多数优化协议，每10LNeonTip可提供5104-2105个细胞。（5105-2106个细胞每100LNeonTip适用于大多数优化的方案。）5. 将含有血清，PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）和胰蛋白酶/ EDTA溶液的培养基的等分试样预温至37。从培养瓶中吸出培养基，并使用PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）冲洗细胞。使用胰蛋白酶/ EDTA或TrypLE Express（目录号12563）对细胞进行胰蛋白酶消化。取一等份的胰蛋白酶化细胞悬浮液并计数细胞以确定细胞密度。将细胞转移到1.5mL微量离心管或15mL锥形管中，并在室温下以100-400g离心细胞5分钟。通过在室温下以
6、100-400g离心5分钟，用PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）清洗细胞。吸出PBS并以1.010 7个细胞/ mL的最终密度将细胞沉淀重悬于Resuspension Buffer R中。 轻轻移液细胞以获得单细胞悬浮液。避免在室温下储存细胞悬浮液超过15-30分钟，从而降低细胞存活力和转染效率。 可以调整重悬细胞密度以适应电穿孔方案（第18页）或优化方案（第24-29页）的推荐细胞数。6. 通过用含有血清和补充剂的0.5mL培养基将孔插入24孔板，不用抗生素，并在潮湿的37/ 5CO 2培养箱中预培养板。 如果您使用其他培养板，请参见第18页电镀介质卷建议。7. 对于每个电穿孔样品，下面列
7、出了每孔的质粒DNA或siRNA的推荐量，细胞数量和电镀培养基的体积。 使用再悬浮缓冲液T作为初级悬浮液8. 使用3 mL电解缓冲液（使用缓冲液E，10LNeonTip和缓冲液E2，100LNeonTip）装入Neon移液管9. 根据您的单元格类型在设备上设置所需的脉冲条件10. 将适量的质粒DNA / siRNA转移到无菌的1.5mL微量离心管中。11. 将细胞加入到含有质粒DNA / siRNA的管中，轻轻混合。 请参见上表，了解细胞浓度，DNA和电镀量。12. 要将NeonTip插入Neon移液器，请将移液器上的按钮按到第二个停止位置以打开夹具13. 将Neon移液器的顶部插入NeonT
8、ip，直到夹具完全拿起活塞的安装杆（见下图）14. 轻轻释放按钮，继续向移液器施加向下的压力，确保尖端密封在移液管上，没有间隙。 注意：确保Neon移液器和尖端紧密连接，无间隙（见左图），无故障移液和正确的电气连接15. 将Neon移液器上的按钮按到第一站，并将NeonTip浸入细胞DNA / siRNA混合物中。 缓慢释放移液器上的按钮，将细胞DNA / siRNA混合物吸入NeonTip。在移液过程中避免气泡，因为气泡在电穿孔期间导致电弧，导致转染降低或失败。 如果您注意到尖端中有气泡，请丢弃样品，并小心地将新鲜样品再次吸入尖端，无任何气泡。16. 将带有样品的Neon移液器垂直插入放置在
9、Neon移液器站中的NeonTube，直至听到咔嗒声。 确保移液器突起插入吸液管的槽中。17. 确保Neon移液器的金属头与Neon移液器支架内的球形活塞和NeonTube（见左图所示的正确位置）紧密连接。18. 在传送电脉冲之前，Neon设备会自动检查NeonTube和NeonPipette是否正确插入。19. 在电穿孔期间监测NeonTip，以查看是否有由于尖端存在气泡引起的电弧（火花）。 电弧导致转染效率低，细胞活力低。20. 交付电脉冲后，触摸屏上将显示“Complete”以指示电穿孔完成。21. 从Neon移液器站慢慢移除Neon移液器，并立即从NeonTip中将样品从移液器上按下第
10、一个停留点，放入含有预热培养基的准备培养基中。22. 我们强烈建议将电穿孔细胞加载到没有抗生素的生长培养基中，这可以大大降低转染后细胞的活力。23. 要放弃NeonTip，请按第二个按钮的按钮进入适当的生物危险废物容器。24. 对剩余的样品重复步骤7-16。 使用两次后，请务必更换NeonTips，并在10次使用后更换NeonTubes。 每个新的质粒DNA样品使用新的NeonTip和NeonTube25. 轻轻摇动板，以确保细胞的均匀分布。 在37下在加湿的CO2培养箱中孵育该板。注意1.如果您没有使用Neon设备，将后面的电源开关转到OFF位置。2. 避免在Neon移液器台内溢出任何液体，
11、以防止移液器台上的球塞上产生锈迹。3. 如果您不小心将任何液体（如缓冲液，水，咖啡）溅入Neon移液器站内，请将主机从主设备上断开，并用干燥的实验室纸擦拭。倒置并允许车站在室温下完全干燥24小时。优化流程1. 确保您按照第16-17页所述制备细胞，使用DNA或siRNA，并制备含有0.5 mL含有血清和无抗生素的培养基的24孔板，以转移电穿孔细胞。 准备足够的细胞和质粒DNA / siRNA进行至少30次转染。2. 对于使用24孔格式的10LNeonTip的每个电穿孔样品，请参见下表。 对于以24孔格式使用100LNeonTip，请将下表中列出的数值适当调整10倍。3. 使用3 mL电解缓冲液（将缓冲液E用于10LNeonTip和缓冲液E2，100LNeonTip）置于含有细胞DNA / siRNA混合物的Neon移液站中，如第15页所述。4. 按优化和加载优化协议开始电穿孔使用下列参数。5. 电穿孔后，立即取出Neon移液器，将样品从10LNeonTip中转移到预热的0.5 mL培养基中。6. 对于100LNeonTip，将稀释样品在900L培养基中稀释10倍，并将100L样品转移至0.4 mL预热培养基中。7. 对剩余的样品重复步骤3-5。8. 轻轻摇动板，以确保细胞的均匀分布。 在37下在加湿的CO2培养箱中孵育该板。
