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1、3肝脏再生ANNA MAE DIEHL重要观念 肝脏是成年人体内唯一的在损伤后具有明显再生能力的重要器官。遗憾的是，这种再生反应常常被干扰，或者难于发生，或者以一种无序的或不完全的方式再生。肝脏再生异常对暴发性肝衰竭、肝硬化及肝癌的病理发生过程起促进作用。 一般而言，肝脏再生的启动是由于肝损伤后肝脏微环境发生改变，增强了对即将死亡的受损细胞的清除和对损伤较轻细胞的修复，以及通过存活细胞的增殖来取代死亡细胞。 针对促进肝脏再生的细胞内外信号系统的研究，提示如何将有害的肝脏微环境转变成有利于其再生的微环境，从而能够预防肝硬化的发生，减少对肝移植的需求。在许多不同类型的肝损伤发生后，肝脏再生是一非常
2、明显的过程，这种再生可以使肝脏的框架结构和组织特异性功能得到完全恢复（1）。肝脏再生发生于肝脏细胞增殖代替已死的亡的肝脏细胞时。成年人肝脏这种巨大的再生能力明显区别于体内其它重要器官，这些器官的再生能力相当有限。在健康成年人的肝脏中，每天会有一些肝细胞发生程序性化死亡，即凋亡，因此除了参与损伤肝脏的修复之外，肝脏再生还是维持肝脏存活所必需的。如果凋亡细胞不被取代，肝脏将逐渐萎缩。肝脏体积保持恒定是因为死亡细胞被一些存活细胞的增殖所取代。最终肝脏体积的大小取决于肝细胞增殖与死亡之间的比率。但肝脏损伤后，由于坏死及凋亡增加，致使肝细胞死亡速率增加。这种损伤启动了肝脏的增殖反应，最终使肝脏恢复到原有
3、的健康状态。在再生过程中，为了恢复组织的完整性，需要平衡肝脏重建的几种细胞群，如肝细胞、胆管上皮细胞、内皮细胞、星状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞以及支持上述细胞的细胞外基质。在过去的30多年中，对肝脏再生调节机制已经有了相当多的了解，这些知识为各种肝脏疾病提供了新的治疗策略。健康成人保持肝脏体积的机制总结相关机制见表3.1。肝脏祖细胞介导下的连续复活肝脏祖细胞（即干细胞）在维持健康肝脏体积中的作用一直以来是争论的焦点，争论之所以激烈原因在于至今未能确定肝脏干细胞的特有标志物（2），因此得到确认的此类细胞数量有限。一般认为这些细胞包括靠近门脉三联处的小型卵圆细胞（3），这种卵圆形的细胞群可能是异质性
4、的，包含一组属于肝脏族系的相对大量的细胞，这些细胞可分化为肝细胞、胆管上皮细胞以及一个多潜能的细胞亚群，此亚群中的细胞含有少数真正的干细胞，它们可分化为上皮细胞（例如，肝脏及胰腺上皮细胞）或者血液生成细胞的细胞组群（4）。正常健康成年人的肝脏具有极低的增殖指数（在任何时点上复制其DNA的肝细胞不足1：1000个）（5），因此认为只有相对少的祖细胞定位于该处。然而，来源于成人骨髓的干细胞能定位于成年受体的肝脏中（6），并分化为肝细胞（7），为肝脏祖细胞在成年人体中持续存在提供了证据。这些细胞产生于骨髓，或者只是通过血液循环途经骨髓（8）。这表明存在于成年肝脏内的少量干细胞可能不断地通过骨髓内的干
5、细胞池得以补充和更新。然而，对于促使干细胞向肝脏募集的信号，以及诱导其扩增、继而分化的因子了解甚少。表3.1 健康成人保持肝脏体积的机制 肝脏祖细胞的不断复活 骨髓起源的多能干细胞定位于肝脏 分化为肝脏祖细胞 幼稚的肝细胞及胆管细胞的扩增成熟肝细胞的复制 受门静脉因素调控 可想而知，在胚胎生成时规定成为肝细胞系的一些机制也同样可以调控成人肝脏中祖细胞的分化。在胚胎发育过程中，肝细胞祖细胞来源于前肠腹侧的内胚层( foregut ventral endoderm),而胰腺的腹侧也同样起源于此。来源于心脏间叶细胞的信号如纤维母细胞生长因子可以诱导其它一些可溶性因子的释放，包括sonic hedge
6、hog(Shh蛋白)，后者与位于内胚层的双向潜能干细胞上的受体相互作用，抑制胰腺分化，同时诱导肝细胞系生成（9）。在小鼠胚胎发育过程中，属于肝脏的祖细胞出现于第8天左右。通常当胚胎发育到12.5天时，包含有大量肝脏及造血祖细胞的肝芽已发育完全（10）。 对小鼠胚胎细胞进行基因操作可确定调控肝脏祖细胞扩增及其向成熟肝细胞分化的特异性因子。例如，这项技术已显示肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）及其受体c-met对于肝脏生长是必需的,因为其中任何一个基因被破坏，胚胎将缺少正常的肝芽，并死于胎儿期的第9到12.5天之间（11-13）。相似的研究结果提示，一般性的
7、存活机制对于此期肝脏生成中祖细胞池的扩增也是必需的。通过阻断小鼠广泛表达的各种编码应激活化蛋白激酶的基因（如MKK4、SEK-1、raf-1及IKK）（14-18）、NEMO/IKK（IB激酶复合物中的一种非催化成分），以及调节凋亡的转录因子（如c-jun、NFB p65RelA、MTF-1及XBP-1）等(19-22)，会使肝脏发育停滞。阻断肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF-）（23）或TNF受体1（24）的基因可恢复Rel A缺失胚胎中肝脏的发生。此发现显示，肝脏祖细胞生成过程中的扩增需要避开TNF-所介导的凋亡反应。这些发现具有特别的相关之处，因为即便TN
8、F-可以引起生后多种肝脏损伤，但是它在启动部分肝切除术（partial hepatectomy, PH）后的肝脏再生反应中也起关键性作用(参见后文)。 通过基因破坏(gene disruption)的研究也试图阐明调节胎儿肝脏中不同类型祖细胞分化成新生儿肝脏中的不同细胞群（包括免疫系统的细胞成分）的机制。这项工作很可能为了解由先天性免疫反应所控制的成年人肝脏疾患（如慢性肝炎）提供有价值的信息。其结果也可用于解释为什么各种类型的慢性肝脏疾病伴有全血细胞减少。例如，破坏小鼠Hex基因可以引起由于肝脏生成障碍导致的胚胎死亡。在Hex+/-异质结合体中单核细胞生成障碍，提示这因子在肝细胞祖细胞及单核细
9、胞祖细胞分化过程中均起主要作用（25）。基于新生儿的肝脏是具有造血能力的器官（26）及骨髓起源的干细胞能够在成年小鼠和人类（7）中分化成肝细胞，因此就需要更好地了解Hex及其调节因素。成熟肝细胞的复制健康成年肝脏中成熟肝细胞的低增殖指数与其低的肝细胞凋亡率相匹配。健康人肝小叶中存在肝细胞DNA的合成梯度，门脉周围的肝细胞具有最高的增殖指数，靠近中央静脉处的肝细胞则最低（1，5）。一些研究者提出，门脉周围干细胞老化过程中出现的增殖活力的进行性下降驱动由门脉到中央静脉的DNA合成梯度的形成（27-30）。另一些学者则提出异议，他们认为从门静脉系统到中央静脉的可溶的肠源性肝脏营养因子的梯度变化，对成
10、熟肝细胞增殖区域性分布的形成起主要作用（31，32）。有证据显示，肝脏祖细胞可以分布于整个肝小叶，并非仅集聚于门脉周围（33，34），这给正在进行的争论火上加油。此外，脾脏的骨髓样环境可以存储肝脏祖细胞，同时可将这些前体细胞通过门脉血流源源不断地送至肝脏。无论如何，门静脉因子（可溶性的或细胞性的）作为日常肝细胞增殖活性的调节因素，已被阻断门静脉血流肝脏将会萎缩的现象所证实（31，32，35，36）。另外，肝细胞增殖在一天中有波动，餐后入肝的门静脉血流增加时，增殖最为明显（37，38）。损伤后肝脏体积恢复的机理对相关机制的总结见表3.2表3.2. 损伤后肝脏体积恢复的一般机理肝细胞增生 成熟肝细
11、胞 肝脏祖细胞肝细胞肥大肝细胞增生成熟肝细胞的增生由于成熟的肝细胞（已分化的肝细胞）在肝脏部分切除达70%或者各种肝脏毒性物质的作用后，其DNA合成及有丝分裂明显增加，因此认为当成年肝细胞受到此类“挑战”时，可以发生增殖反应（1）。然而尽管历经数十年的研究，成熟肝细胞最终的增殖能力仍不清楚。健康肝脏中大多数成熟的肝细胞合成DNA并不活跃。对成年肝脏中生长相关基因表达深入分析显示，多数成年肝细胞已退出细胞增殖期，其生命中的大多数时间处于静止期（G0）。问题是这些细胞能否再次进入细胞周期并进行复制。 为回答上述问题，已经采用了多种方法包括成熟肝细胞的分离及原代培养。在有生长因子的培养液中，成熟肝细
12、胞可上调复制前基因（如c-jun基因），并合成DNA,但是肝细胞的增殖不佳，假如亦表现有增殖的话（39）。然而,体外实验中肝细胞的低增殖能力，可能仅仅是由于复杂的分离步骤和培养条件欠佳人为造成的一种假象（40-44）。另外的一些实验方法，例如应用大鼠肝细胞做移植试验，显示成熟肝细胞在体内依然保持着相当的增殖能力。在一项研究中，从成熟供肝中分离出肝细胞，标记后移植到受体大鼠的一个肝叶中，而此前其它肝叶的门静脉均被结扎（45）。去门脉血流的肝段退化，但最终整个受体肝脏的体积可由供体肝细胞而得到恢复。根据移植肝细胞的数目，作者得出单一的肝细胞至少可以分裂34次，产生1.71010个子细胞。这意味着着
13、大鼠的一个肝细胞具有克隆产生50个成熟大鼠肝脏的潜力。然而，不能排除用于此项研究中的供体肝脏细胞可能含有一种或两种多能干细胞的可能性。也许对成熟肝细胞增殖能力最古老且最被广泛接受的论断是，对成年肝脏行部分肝切除术后，剩余可以再生（46）。的确，关于普罗米修斯的古希腊神话中反复提到肝脏具有当其部分被取掉后再生恢复的能力。部分肝切除后的肝脏再生与临床肝切除、肝外伤、肿瘤外科、劈离式肝移植及活体肝移植术后病人的康复有密切的关系。通过对大鼠部分肝切除术后肝脏再生过程的研究，可了解到许多人类肝脏正常再生的可能调节机制。对此将在后续章节中讨论。干细胞增生近5年来的许多研究显示，肝脏祖细胞持续地存在于成年机
14、体内。其中一些研究表明在某些条件下，这些细胞使受损的肝脏再生。例如，用药物预先抑制相对成熟肝细胞的增殖后行肝脏部分切除术，发现正常小卵圆细胞家族中的一些细胞（定位于肝脏中的祖细胞）可使剩余肝脏增殖并重新构建（47-49）。这个发现提示即使是在成年机体中，肝脏祖细胞的再生能力也是巨大的。最近Grompe研究小组对此也提供了更为肯定的证据。这些研究者通过将健康野生型供体的骨髓干细胞移植给FAH敲除小鼠(一种酪氨酸血症模型)，能够使受到致命性毁损的肝脏达到完全再生（7）。这些结果使肝脏再生研究者的思维发生了革命性的变化，为探索肝脏再生开辟了新的道路。因此，必须对慢性肝脏疾病中内源性干细胞的作用，以及
15、通过干细胞移植治疗急慢性肝脏损伤的实用性等重要问题进行更为专注的研究。肝细胞肥大肝细胞的增大（肥大）存在于许多肝脏疾病中。来自Thorgeirsson研究小组（50）的报告显示，肝细胞肥大常发生于肝脏增殖受限时，是恢复肝脏体积的一种代偿机制。用地塞米松或5-氟尿嘧啶抑制肝细胞增殖后，对这种大鼠行PH，肝脏可恢复原有的体积，而未发现肝脏DNA的诱导合成。肝脏体积的恢复主要依赖于门脉周围肝细胞的增大/肥大。这种肥大的状态是不稳定的，因为一旦解除抑制DNA合成的因素，增大的肝细胞将进入细胞周期，正常的肝脏结构及DNA含量将得以重建。人类的肝脏再生肝脏再生的重要作用在暴发性肝衰竭病人中表现的非常明显。
16、然而，除一些罕见的情况外，无论肝脏何时受到损伤，再生反应总会发生。慢性病毒性肝炎、发生排斥反应的肝脏同种异体移植物、药物性肝炎以及自身免疫性肝脏疾病等的肝活检显示，肝细胞核内增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）及Ki-67等S期蛋白增加，说明确有肝脏再生反应的发生（51）。仅有两种常见原因（酒精性52）及非酒精性脂肪肝53）引起的肝脏损伤通常可以抑制肝细胞的增殖。然而多种原因的急性肝脏疾病，在修复过程中可抑制存活肝细胞发挥其正常功能（54，55）。与之相似，各种类型的慢性肝脏疾病破坏了死亡肝细胞的替代与细胞外基质的重建之间的平衡机制（51）。最后，维持肝细胞死亡与增殖的平衡机制在许多慢性疾病过程中也出现
