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2、论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文 中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成 果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名：主。I 袍 刷磁之憋二月日口，、年月日 中文摘要 英文摘要 研究论文 前言 材料与 结果，H l 、 附图 附表 讨论诃论 结论7 1 _ lr U 参考文 综述免疫 致谢5 6 个人简历5 7 中文摘要 依硫磷酸抑制白血病细胞生物学活性、保护骨髓基质细胞及对化 疗药物抗白血病作用影响的实验研究 摘要 目的：白血病( 1 e u k e m i a ) 是一类造血干细胞的恶性克隆性疾
3、病，我 国白血病的发病率约为2 7 6 l O 万年，在所有恶性肿瘤死亡率中，白血病 居第6 位，而在儿童及3 5 岁以下成人居第l 位。近年来白血病的治疗不 断优化，除传统化疗、造血干细胞移植外，以急性早幼粒细胞白血病诱导 分化治疗为代表的靶向治疗以及免疫细胞治疗已取得很大进步。白血病治 疗中化疗耐药以及化疗药物和白血病细胞抑制骨髓增生仍是迫切需要解 决的临床难题，是影响疗效和预后的关键因素。 依硫磷酸的中文通用名为氨磷汀，英文名称E t h i o f o s 、A m i f o s t i n e 、 W R 2 7 2 l 或E m y o l ，是第一个被国际权威机构认可的广谱细胞
4、保护剂， 最先由美军陆军研究所开发出来，用作核辐射和化学武器损伤的防护。 1 9 9 6 年美国F D A 批准依硫磷酸上市，用于预防化疗不良反应，起到保护 骨髓、肾脏及心脏等器官的作用。通常认为，依硫磷酸发挥细胞保护作用 的经典药理机制为碱性磷酸酯酶途径。近年来，研究发现依硫磷酸具有多 方面的生物学作用，主要有类造血细胞生长因子作用以及诱导肿瘤细胞凋 亡、抑制细胞周期和抗血管生成等抗肿瘤作用，而这些作用的机制无法用 经典的碱性磷酸酶途径来解释。目前，有关依硫磷酸对白血病细胞及骨髓 基质细胞的生物学活性影响是否存在差异尚不明确，在临床白血病化疗中 应用依硫磷酸保护正常骨髓的同时是否会保护白血病
5、细胞以及对化疗疗 效的影响还不清楚。 本实验以人急性巨核细胞白血病细胞株D 锄i 、急性早幼粒白血病细 胞细胞株H L 6 0 及非恶性血液病患者的原代骨髓基质细胞( b o n em a 舯w s t r o m a lc e l l ，B M S C ) 为对象，研究了依硫磷酸对白血病细胞和骨髓基质细 胞增殖、周期、凋亡的影响，以及对具有不同作用机理的化疗药物如阿糖 胞苷和长春新碱抗白血病作用的影响，并检测了D a m i 相关基因表达变化， 初步探讨了依硫磷酸抑制肿瘤细胞增殖作用的分子机制。 方法：采用C C K 8 法检测依硫磷酸对D a m i 、H L 6 0 及B M S C 增
6、殖的 中文摘要 影响；倒置显微镜观查细胞的形态学改变；D N A 琼脂糖凝胶电泳观测凋 亡的梯形条带，加m e x i n I 双染色流式细胞术检测细胞凋亡情况；P I 染 色流式细胞术检测细胞周期及倍体变化；荧光实时定量P C R 法检测细胞 凋亡相关基因b c l 2 、c a s p a s e 3 、细胞周期相关基因c y C l i I 认、c y c l i n B l 、 c y c l i I D l 和巨核细胞分化相关基因G A T A 1 、N F E 2 训 A 表达水平的变 化。 结果：1 依硫磷酸对D a m i 、H L 6 0 的增殖具有抑制作用，终浓度为 O 3
7、 5 m g I n l 、O 7 5 m g m l 、1 5 m 酌：1 1 1 的依硫磷酸作用2 4 h 、4 8 h 、7 2 h ，抑制 率呈浓度和时间依赖性增加，作用4 8 h 对D a m i 、H L 6 0 的抑制率分别为 5 6 4 2 、8 9 7 2 、9 2 0 8 和4 3 8 6 、8 0 4 7 、8 6 5 ，作用4 8 h 的半数 抑制浓度分别为O 2 5 m g m l 和O 3 7 m g m l 。但相同浓度范围的依硫磷酸作 用4 8 h 对B M S C 增殖无影响。2 终浓度为O 3 5 m m 1 、O 7 5 m m l 和1 5 m 咖l 的
8、依硫磷酸作用D 锄i 、H L 6 0 细胞2 4 h 、4 8 h ，细胞凋亡增加。不同终浓 度依硫磷酸处理D a m i 细胞2 4 h 后总凋亡率分别为9 1 2 3 士3 7 6 6 、 1 1 3 2 0 士1 5 3 0 、1 1 8 9 0 士3 2 0 0 、1 7 5 4 3 士3 3 6 5 ；4 8 h 后总凋亡率分别 为6 7 2 7 士3 1 2 6 、2 0 2 0 3 士5 1 1 5 、3 0 0 2 3 士6 4 3 3 、6 3 3 9 7 士2 4 0 6 4 ，且 呈浓度和时间依赖性。相同浓度的依硫磷酸作用于H L 6 0 细胞趋势相同。 相同浓度范围的
9、依硫磷酸作用于B M S C2 4 h 、4 8 h ，细胞凋亡无改变。3 终浓度O 3 5 m g m l 、O 7 5 m 酌m 和1 5 m 咖l 的依硫磷酸作用D a m i 细胞2 4 h 、 4 8 h 。2 4 小时后，未处理组G O G 1 期细胞比例平均为4 6 2 8 ，处理组平 均为1 4 1 9 ，未处理组G 2 M 期细胞比例平均为1 3 3 9 ，O 3 5 m I n l 依 硫磷酸处理组平均为6 8 2 0 。4 8 小时后，未处理组G o G 1 期细胞比例平 均为4 3 5 7 ，处理组平均为4 2 7 ；未处理组G 2 M 期细胞比例平均为 1 5 6 5
10、 ，处理组G 加期细胞比例平均为6 7 8 2 。G O G l 期、S 期细胞减 少，G 2 M 期细胞增多。4 低浓度依硫磷酸( O 3 5 m m 1 ) 对阿糖胞苷抑制 D 锄i 、H L 6 0 增殖作用无影响，可增强长春新碱对两株细胞增殖的抑制 作用。依硫磷酸对阿糖胞苷抑制B M S C 的作用无影响，但可减轻长春新 碱对B M S C 的抑制作用。5 低浓度依硫磷酸( O 3 5 m g n 1 1 ) 对阿糖胞苷和 长春新碱促进D 砌、H L 6 0 凋亡作用无影响。6 依硫磷酸作用D 锄i 细胞 后2 4 h ，O 7 5 m 幽【n 1 和1 5 m 砒组b c l 2m
11、】5 m A 表达减低为对照组的O 3 0 7 和O 5 3 2 倍( p O 0 5 ) 。 小浓度依硫磷酸O 3 5 m m l 联合不同浓度V C R ( 1 m g L 、5 m L 、l O m g L ) 分别处理细胞2 4 h 、4 8 h ，或单用不同浓度V C R ( 1 m g L 、5m L 、 l Om g L ) 处理细胞，测定依硫磷酸联用周期特异化疗药V C R 对D a m i 、 H L 6 0 及B M S C s 细胞增殖的影响iC C K 8 检测结果显示( 表6 、7 、8 ；图 1 1 、1 2 、1 3 ) ；单用V C R 以及与依硫磷酸联用组均导
12、致肿瘤细胞D 锄i 、 H L 6 0 增殖程度明显减低，且联用依硫磷酸组比单用V C R 组的抑制程度 明显，差别有统计学意义( P O 0 5 ) 。但依硫磷酸联合化疗药V C R 处理正 常骨髓基质细胞，能明显减弱化疗药的抑增殖作用，差别有统计学意义 ( p o 0 5 ) 。 3 细胞凋亡检测 利用A 1 1 1 1 e x i nV - F I T C 和P I 双染色标记细胞，流式细胞术检测细胞的 凋亡率，结果显示依硫磷酸( O m g “、O 3 5 m g m l 、O 7 5 m g m l 、1 5 m m 1 ) 作用于D 锄i 细胞2 4 h 后总凋亡率分别为9 1 2
13、 3 士3 7 6 6 、1 1 3 2 0 士1 5 3 0 、 1 1 8 9 0 士3 2 0 0 、1 7 5 4 3 士3 3 6 5 ；4 8 h 后总凋亡率分别为6 7 2 7 士3 1 2 6 、 2 0 2 0 3 士5 1 1 5 、3 0 0 2 3 士6 4 3 3 、6 3 3 9 7 士2 4 0 6 4 。细胞总凋亡率随着处 理药物浓度的增加及处理时间的延长有增加趋势，但O 3 5 m m l 、 O 7 5 m I I l l 两组与O m g m l 组之间比较无统计学意义，1 5 m m l 组细胞凋 亡率明显增加，实验重复三次，差别有统计学意义( P o
14、0 5 ) ( 表9 、l O ， 图1 4 ) 。相同条件检测H L 6 0 细胞凋亡情况，可见相同趋势。 ，流式细胞术检测B M S C s 0 3 5 m m l 、1 5 m m 1 ) 作 ，流式细胞术检测细胞的 合化疗药阿糖胞苷、长春 药无明显变化。区别无统 ( 表1 1 、1 2 ) 4 细胞周期的检测 利用P I 染色标记细胞，流式细胞术检测细胞的周期，结果显示单用 O 3 5 m 咖l 依硫磷酸作用D a m i 细胞2 4 、4 8 小时后，细胞周期分布发生明 显变化，G O G 1 期细胞比例较未处理组明显减低，G 2 M 期细胞比例增加 ( 图1 6 ) 。2 4 小时
15、后，未处理组G O G 1 期细胞比例平均为4 6 2 8 ，处理 组平均为1 4 1 9 ，未处理组G 2 M 期细胞比例平均为1 3 3 9 ，O 3 5 m m l 依硫磷酸处理组平均为6 8 2 0 。4 8 小时后，未处理组G O G 1 期细胞比例 平均为4 3 5 7 ，处理组平均为4 2 7 ；未处理组G 2 M 期细胞比例平均为 1 5 6 5 ，处理组G 2 M 期细胞比例平均为6 7 8 2 。有明显G 2 M 期阻滞 趋势。H L 6 0 细胞未检测。 5 依硫磷酸作用D 锄i 细胞后相关基因表达检测 应用R T - P C R 进行相关基因的测定时，先观察R T - P C R 融解曲线，曲 线均是单一、锐利的峰型，排除非特性扩增。本试验中所有实时荧光定量 扩增产物经l 琼脂糖凝胶电泳分析，产物符合目的基因片段大小( 图 1 7 2 1 ，表1 3 ) 。 5 1 细胞凋亡相关基因c a s p a s e 3 、b c l 2 m R N A 表达量 不同浓度的依硫磷酸( O m 鲋叫、O 3 5 m m l 、0 7 5 m I n l 、1 5 m m 1 )
