《低聚果糖转移酶的分离纯化及性质研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《低聚果糖转移酶的分离纯化及性质研究（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生产制备技术与制荆研究论文全国 第六届工业生化学术会 议 f 1 9 9 9 ,福 建) 论文集 低聚果 糖转移酶的 分离纯化及性质研究 赵玉秀金之 男吴志龙秦克壳高放杨光礼 上海医药工业研究院， 上海2 0 00 4 0) 摘 要:米曲 霉 A s p e r g i l l u o r y z a 。 发 酵液，经硫 酸按分 级 沉淀 ，D E A E c e l l u l o s e , D E 一 5 2吸附 洗 脱，D E A F一 S e p h a d e x 一 A 5 0 ;A , 子交 换 柱层 析，S e p h a d e x G一 2 0 0 凝胶过滤及狂基磷灰石吸
2、附柱层析等步骤， 得到了聚丙烯既胺凝胶电 冰均一的低K果 糖转移酶. 得率4 . 4 %，比活力为3 5 1 3 u / mg , 纯化了1 5 5 5 倍. R 1 S D S - 聚丙烯鱿胺 凝胶电泳测得分子量为8 . 0 6 1 6 x 1 0 0 低聚采糖转化酶录过p H为6 . 4 ;反T最适温度 6 0 C，有较好的A稳定性，低聚果糖转移酶对底物蔗糠的表观1 m 值为0 . 6 5 M 羊位i i:低畏4.低聚笑A转M ,4 .米曲霭.纯化和性质 舀 低聚 果糖，又 称 寡果糖( F r u c t o o li g o s a c c h a r i d e s ) ，是 功能
3、性低 聚糖， ， 颇具代 表 性的 种 是 蔗糖 分子的 果搪 残基上 通 过0 一( 一 2 一 1 一) 位 连接1 3 个果 糖单位 的非 还原 9 尽竹 低 聚果精 在蔬菜 、水果 、蜂 蜜 等食.i ll , 丰 ， 厂泛存t + . , ! ! 数 量作 常 有 限， 因此 在 _ 业L 通常 采01, 1 1 物 发酵法利用 微生 物在发 酵 过程 P , 生的I t 一果 糖软移 酶 ( l ; - f r u c t o s y l t r a n s f e r a s e , E C 2 . 4 . 1 9 9 ) 或户 一 吱喃果 糖若 酶 ( 1 1 一 f r u
4、c t o f u r a n o s i d a s e , E C 3 . 2 . 1 . 2 6 ) 作用1 蔗 价底 物， 进行 分子 内 果搪竹转移反应而生成低聚果糖 经 研 究 发 现， 能 产 生 上 述 酶 的 微 生 物 存 A s p e r g i l l u s n ig e r , A s p e r g i l l u s o r y z a e , A u r e o b a - s i d i u m p u l l u l a n s 等 多 种微生 物找 们筛 选得 到( A s p . n i g e r 和 A s p . o r y z a e 优良
5、产酶菌 种，许 对 米曲 4 ( A s p e r g i l l u s o r y z a e 产 生的 / 3 - D一 果搪 转移 酶进行f 分离 纯化 1 k f t 学It . 质的 研究 对 黑曲霉 ( A s p . n i g e r ) 产生的f ; 一 D一 果糖转移酶的分离纯化及酶学性质研究将另文报道 1 材料与方法 略 ) 乌 2 结果和 讨论 2 . 1酸的 纯化 米曲 霉 A s p e r g i l lu s o r y z a e 发 酵 液通 过硫酸 钱分 级沉淀 ，离 子交 换层析 ，凝 胶过滤 和经基 磷灰 石柱等分离步骤对低聚果糖转移酶蛋白进行了纯
6、化，分离纯化结果见 表1 从表中数据可以看出8 0 %磷酸被盐析可以除去大部分的杂蛋白，经几次柱层析分离后，低聚 果糖 转移酶 的比活 力由 2 . 2 6 u / m g 提高 到 3 5 1 3 u / m g , 酶蛋白 被纯 化1 5 5 5 倍 ，回 收4 . 4 % ,纯化后 的低聚果糖转移酶的聚丙烯酞胺凝胶电泳结果仅呈现为条带，见图1 , 2 ，醉的基本 性质川 2 . 2 . 1分子童 3 0 8 生产制备技术与制荆 研究论文 全国第六届 工业生化学术会 议 ( 1 9 9 9 ,福建) 论文集 体积酶话 创L) 发醉1 5 7 0 5 5 %上清1 7 6 0 8 0%上清1
7、 1 1 透析后1 5 0 D E5 2 后1 0 . 6 A 5 0一次下柱5 A 5 0 二次下柱1 .5 G一 2 0 0 下柱1 .8 径基磷灰石下c ; 18 表1 低聚果糖醉的纯化 蛋f 于比活 ( u )( mg) 1 9 7 4 7 8 7 5 0 1 7 1 2 3 7 3 5 0 1 6 1 5 4 9 9 0 1 5 8 6 2 5 4 5 1 4 1 7 2 9 1 . 8 1 0 5 6 2 5 7 .2 8 6 2 8 6 1 1 . 9 9 2 2 8 6 .4 1 . 8 5 8 7 4 . 8 0 . 2 4 9 纯化倍数 u /-9) 2 . 2 6 2 .
8、 3 3 1 6 .3 2 9 .1 2 5 4 .4 .4 6 8 . 8 5 2 4 .0 1 2 3 5 . 9 351 3 1 . 0 3 7 .2 2 1 2 .8 8 6 8 . 3 2 1 6 3 .1 8 2 3 1 . 8 6 5 4 6 . 8 5 15 5 5 收率 % ) 1 0 ( 1 86. 7 8 1 . 8 8 0. 3 7 1 . 8 5 3 - 5 3 1 . 8 11 . 5 8 4. 4 粤 A B C D E 徽漆娜 嵘 鸯 A E . H y d r o x y l a p a t i d e B DEA E 一c e l l u l o s e D
9、E 一 5 2 C DEAE一S e p ha d o x A一5 0 ( 2) D S e p h a d e x G一 2 0 0 一攫黔碳嗽 臀 ;孤 禅 绪 转 笋 一 撼 沁 资 乡 感 葬 势 淤瓣粼舞 膺 瓣 餐 馨 图1低聚果糖转移酶聚丙烯概胺凝胶电泳图i s 纯化 后的低聚 果糖 转移酶 经S D S 聚 丙烯 酞胺 凝胶电 泳， 叮 以 从图 谱图 2 上看到 一 条 带， 从 低 分 子 量 标 准 蛋 白 对 数 标 准 曲 线 上 查 得 该 酶 分 了 量 为 8 . 0 6 1 6 x 1 0 粤 2 . 2 2P H 对酶活力 的 影响 改 变反应体系 的 p
10、H( 其 他条件不 变) 侧定 低聚 果糖 转移酶 在p H 4 .。 一 1 0 . 0 缓 冲液中 酶的 相对 活力 该酶 最适 p H 6 .3 适宜 p H 为 6 . 。 一 6 .5 , p H 高于 7 。 酶 活1; 降 22 . 3液适温度 在最适p H的缓冲液中，分别测定该酶在2 5一 S 0 C的不同温度下 的酶活力、 酶的最适温度为 6 0 C _ 5 5 一 6 5 为酶IR 应适宜温度。高于7 0 0C酶的残余率低于4 0 % 3 0 9 生产制备技术与制荆研究论文 全国第六届工业生 化学 术会 议 ( 1 9 9 9 ，福建) 论文 集 低聚果精转移酶( 8 0
11、6 1 6) 电 5 聋 气 厂 瞥 1 袂 6 .2 厂不 一 - 6 .0 r 0 - 0 , 5 .8 卜飞 IgMw 5.t65.45.2 6. U. es 钾 es J 神 一 0. 1 0 . 30. 汤0 . 7 F 为 I兔磷酸化 酶 B 9 7 , 4 0 0 ) 2 牛血清白蛋白 ( 6 6 , 2 0 0 ) 3 兔肌动蛋自 4 3 ,0 0 0) 4 牛碳酸肝酶 ( 3 1 ,0 0 0) 5 胰蛋白酶抑制剂 ( 2 0 , 1 0 0) A 低分子量标准蛋日 B 低聚果糖转移酶 C 次高分f t 标准蛋白 嘴 CP 3 2 S DS一聚丙烯酞胺凝胶电泳侧定低聚果糖转移
12、酶分子堆 一介 一!1.卜rlLI n曰只门咬口 nj曰乙nll 一弃、二裳磁 一ID . 图3P H对酶活的影响 2 . 2 . 4表观米氏常数K m 测定 低聚果 糖转移酶 在不 同底 物浓度 手( 0 . 0 5 M一 2 M) 的 反 应初 速度，以蔗 果三 糖 ( G F 2 ) 产生 速率f 1 / v ) 对 底 物浓度 1 / s 用 L i n e w e a v e : 一 B u r k 作 图法 ，求出 酶 对底 物蔗 糖的 表 观米 氏常数Km为0 . 6 5 M 3 1 0 生产 制备技术与制剂研究论文 全国第六届 工业生化学术 会议 ( 1 9 9 9 ,福建)
13、论文集 陈瑞娟，食品与 发醉工企，1 9 9 3 ( 2 ) : 8 2- 9 0 仓 JIJk护飞几L丁1.，飞奋号t.IJesL n曰nnlln日户扭曰 6乌Jqq汀今乙1 1巴口照谧 2 0 “ 1 4 0 i 0 ( 4 ) T O产 0 温 瓜 - 图4温度刘酶活的影响 登 f / s 图5双倒数法测定低聚果精转移酶的米氏常数 参考文献 R 高秀昌 ，f - 山 匡男 ，化 学 ， 生 勿，1 9 8 5 , 2 3 ( 9 ) : 6 0 0 - 6 0 5 鲁子贤，鱼白质和肺学研羌力法，第 1 版，北京，科学出版社，1 9 8 9 : 3一 5 张龙翔，张yl l 芳，李令媛等.
14、全1l : 实 珊-j M和井术，第一版北京，人民教育出版社， 1 9 81 : 9 4 1 1 2 莽克 强 徐I j 正 ， 方荣祥 ，聚丙 稀脱胺姿 胶电泳 ，第 一 版 ，北京 ， 科学出 版社 ，1 9 7 5 43 一4 8 张龙翔，张k 1 芳，李令媛等，生化实 瀚方从和技术，第一版， 北京，人民教育出版社， 1 9 8 1 :1 9 6- 1 9 7 Ma s a o Hi r a y a ma , N a o mi 5 u mi , H i d e ma s a H i d a k a ,彻 r i . B i o l . C h e m. 1 9 8 9 53 ( 3 )
15、; 6 6 7 6 7 3 扮 3 1 1 生产制备技术与制荆研究论文 全国第六届工业生化学术会议 ( 1 9 9 9 ,福建)论文集 8李建武，萧能庚.余瑞元等，生物k学实奚I F, V AY和方法，第版、北京，比 京大学出版 Vi i , 1 9 9 4: 3 2 7一3 3 3 P u r i fi c a t i o n a n d P r o p e r t i e s o f 产 一 F r u c t o s y l T r a n s f e r a s e f r o m A s p e r g i l l u s Or y z a e S I P I 6 0 2 . Zhao Yu xi u ( Sh a n g h a J i n Z i n a n Wu Z h i l o n gQi s K e l i a n C a o P a n Y a n U u u n g h I n s t i t u l e 了P h a r ma c e u t i c a l I n du .s l r y . S h a n g h a i 2 0 0 0 4 0 ) 母 . 31 2
