低聚糖酶法合成新方法

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1、表4 切换时间对纯度和回收率的 影响 切换时间 产品纯度( %) 回收率( %) 6 2 5 “ 9 2 4 0 6 4 5 “ 9 0 4 9 . 5 6 5 5 “8 6 7 0 . 5 3 结论 1 ) 单柱实验表明， 分离F O S 树脂较好的是N a 型C Y X - A 2 ) 适宜的分离温度是6 0 C 。 3 ) 利用S MB 系统可连续获得纯度9 0 %以上F O S 。 但 在纯度8 5 %以 上回收率随 纯度升 高 降低较快。 低聚糖酶法合成新方法 P i e r r e Mo n s a n , F r a n c o i s P a u l , Ma g a l i

2、R e m a u d和Ag u s t i n L o p e z ( 开 麦诺和诺德公司供稿) 摘要 酶催化剂的工业应用大部分为水解反应。但现对酶法合成反应越来越重视。用低聚搪生 产方面的例子来说明取得有效的合成反应而不涉及费用大的辅助因数是可能的. 考虑了3 种主要的方法: 一、 逆转水解反应， 通过改变反应平衡的位置; 二、 “ 异水解” 反应， 使用水解酶的转移酶活性; 三、 转移反应， 用转移酶来催化。 对这3 种方式各自 的优点和缺点进行了比 较。 以这些 方法获得的低聚搪可用于不同的方面: 例如 食品 和饲料 配料、 医 药和免疫产品以 及 化妆品添加剂等。 引言 大部分 的具

3、有工业意义的酶法反应是水解反应， 即降解反应: 9 0 %量的 工业用酶为水 解酶 ( 蛋白酶、 碳水化合物酶和脂肪酶) 。 但 是， 酶催化的 未来带来了 在合成反应方面 取得 重大突破的可 能性， 这已 变得显而易 见。 在生 物系统中， 这样的合成反应一般涉 及到了反应过程中 按化学计量计算而消耗的 辅助 因数( 辅酶 t , 辅酶 d 、 三磷酸腺普) 。 这带来了辅助因数再生的间题， 这到目前为止限制了 1 5 9 . 这种类型的酶 法合成反 应的工业应用。 通过使用以下的 方法寻找到使用昂 贵的辅助因 数的 一种替代方法; 逆转水解反应: 根据水解反应大部 分为 平衡反应的事实，

4、可以限定生 产条件以 把反应 平衡 有效地转向合成; “ 异水解” 反应: 水解酶( 酶名称的第3 类， W e b b 1 9 8 4 ) 可把一部分的初始基质转移到 其它 受体而不是水上( “ 正常的” 水解反应) ， 这祥催化了 “ 异 水解” 合 成反应; 转移反应: 转移酶( 酶名称的第 2 类， We b b, 1 9 8 4 ) 能催化把一种化学物质的一部分从 一个“ 供体” 转移到一个“ 受体” 上. 我们 将以低聚糖酶法合 成方面的 例子来说明 这3 种方 法。 由 于低聚糖的技术和生 理性能， 它们被列入 越来 越多的 研究计划中。 由 于采用高强度甜味 剂( 天 冬甜姆

5、和对稳定 剂或 疏松 剂的孺求， 在 食品 应用 方面已 强调了低聚 糖的 技术 性能. 它们的粘度和持水性能是开发低热蚤新饮食的关键。低聚糖的生理性能来自于它们的生理化 学和它们特有的 生理特性。 在一段时间内， 这些低聚糖所包含的 被认可 的特殊机理( 免疫 性、 细 胞粘合、 益菌助生质( p r o b i o t i c s ) . . . . . . ) 被低估， 但它对于人类和 牲口应用 具有重大的意义. 1 , 逆转水解反应 逆转水 解反应基于 改变一种水解反应平衡位置的热动可能 性: A 一 H十 B 一 O H ;些叁A 一 B + H 户 根据质t 作用定 律， 可以通过

6、以下的方法达 到把这样的一 种反应平衡从水 解改 变成合成: 提高基质的 浓度 降低水的活性 通过沉淀， 提取或改性去除最终产品 通过逆转水 解反应来 合成低聚果 糖的 可能性已 经知道多年( B o u r g u e l o t 等 人， 1 9 1 3 ) ; 在有 一浓缩的葡萄 精溶液不 存在的 情况下币一 糖昔酶( 苦杏仁酶; E . C . 3 . 2 . 1 . 2 1 ) 能在两个有萄枪 分子之间造成一 个搪昔 健。 由于这一初步的 成果， 一些塘普酶已 被用 来进行逆转水解反应。 举 例如下: 1 . 1 低聚荀萄糖的合成 P e a t 等人( 1 9 5 2 ) 已 建立

7、起了 在有浓缩葡萄糖溶液存在的情况下由俘 一糖昔酶合成的各种 糖昔键。 通过酶法逆转水解反应获得了 所有的可能类型的潜在的异构 体。 把一种葡萄糖分子 供体转移到另一个葡萄糖分子( 受体) 的C -2 , C - 3 , C - 4 和C -6 的位 置上产生4 种还原双 糖， 分别相当于槐二糖、 昆 布二糖、 纤维二糖和龙胆二 糖的 合成。 缩 合两 个葡萄糖分子由 它们的 异构物 轻荃 基团而 产生的 一种非还原双糖 S , R - 海藻 糖， 也以痕量存 在于反应混合物中。 这个例 子清楚地表明， 当使用 逆转水解条件 时酶合成 反应的非专一性.值得注 意的 是， 由 于主要的 经墓基团

8、的 较高的反应性, a ( 1 -6 ) 糖普键比其它 类型的糖昔键更利于形成。 最近， A j i s a k e 等人( 1 9 8 7 a ) 测定了生理化学反应条件的影响， 以促进在一种 9 0 %的葡萄 搪溶液中使 用提纯的0 -糖昔酶的低聚葡萄糖的 合成. 它们达到了在5 5 C 下培养2 4 小时之后 4 0 % 的合成 得率。 反应温 度高看来促 进低聚葡萄糖合成反应. 1 . 2 低聚甘露糖的合成 在有植 物a 一 甘露糖昔酶和浓缩甘露糖溶液存在的情况下使用逆转水解进行低聚甘露的 1 6 0 合成在多年前已 有叙述( C o u r t o i s 和L e D i z e

9、t 1 9 6 1 ) 。 产生两种双糖: a - D - 毗喃甘露糖荃( 1 -6 ) - D -毗喃甘露 糖和一种 未鉴定的异构 体。 然而， 甘露糖的 浓度 太低( 约2 0 %, w/ w) 而没 有获得重大的合成得率。 J o h a n s s o n 等人( 1 9 8 6 ) 最 近在非常高的甘露糖浓度( 8 5 %, w / w ) 存在的情况下在7 5 C 温 度 下 使 用 四 季 豆 。 一 甘 露 糖 普 酶 对 低 聚 甘 露 的3 种 异 构 体 进 行 了 最 佳 命 成 。 在 该 反 应 的 较 晚 阶 段还得到较长的低聚 糖链。 双糖的 最大得 率为3 7

10、 %( 按糖化物的总 量计算) 。 特别是由 于使 用了非常高的基质浓度， 该酶制剂在这样的反应条件下是极热稳定的。 1 . 3 低聚半 乳糖的合成 S t e p h e n 等 人( 1 9 6 2 ) 使用 存在于较粗制的苦杏仁酶制剂中的A 一半乳糖昔酶活性， 首次证 明了 通过逆转水解的3 -0 一 和6 - 0 - 日 - D -毗喃半乳糖基- D 一半乳糖的酶半合成。 该反 应混 合物含有2 5 % ( w / w ) 的 初始半乳糖浓度并在 室温下培养5 天。 值得指出的是， 为了 吸收在该逆转水解反应过程中产生的低聚 糖， 在此工作中首次使用了 活性碳， 这样把热动 反应平衡朝

11、着合成转变。 为了 专门 提取低聚糖， A j is a k a 等人( 1 9 8 7 b ) 还能 过使用活性碳， 从半 乳糖 供体和果糖受体 提高了二蔗酮糖和 a l l o l a c t u l o s 。的合成得率。通过使用逆转水解反应， 它们显示了在有杆菌 s 一半乳搪普酶存在的情况下在有选择地吸收低聚糖到活性碳上之后回收单糖溶液的可能性。 在逆转水解反应中使用糖昔酶的一些缺点是 : 由于不利的热动平衡位置， 合成得率 低; 获得一种难以 分离的异构体混合物( A j is a k a 等人， 1 9 8 7 a ; J o h a n s s o n 等人， 1 9 8 6 )

12、 ; 由于在浓缩的糖溶液中糖昔酶的活性有限， 一般需要反应时间长和酶浓度高。 另一 方面， 必须强调的是由 于以 下的原因而使用逆转水解反应用糖普酶来催化低聚糖的 合成可能是有用的: 糖昔酶的可获得 性和稳定性: 水解 酶广泛存在， 并且一般可从便宜的来源( 植物和微 生物来源) 进行生产。 这便可以在反应 混合物中使用高的酶浓度。 酶活性在浓 缩糖溶液中 常常 要比 在稀 释的 标准反应混合物水溶液中实际上低1 0 0 1 0 0 0 倍。 然而， 由于酶在 这样条件下的 极高的稳定 性， 因此提高反应温度 是可能的( M o n s a n 和C o m b e s 1 9 8 3 ) 。

13、 此外， 高 温提高了 糖的 溶解度， 可使用更高浓度的基质并使热动平衡向合成更加有效地转变( J o h a n s s o n 等人、 1 9 8 6 ) ; 有可能得到在夭然来源中和用其它方法合成的均无发现的低聚搪结构。 2 , “ 异水解” 反应 水解反应包括了把一种化学物质的一部分转移到一个水分子上去。 除了这种反应以外， 水 解酶还可以催化到水以外其它受体上的这样一种转移。反应机理一般包括了一种中间酶基质 _ _ ， 、_ _ _ _ ， 声A - H _ _ _ 。 . _ 共价的络合物: A-O-B ( 供体) +E-H( 酶) -E -B +C -H( 受体) -B -C +

14、E -H H, O - 幸 B-OH十E-H 这样， 催化 糖昔键， 即糖普酶的水解， 便可通过使用这样一个转糖普作用机理获得合成反 应 。 这种反应的效果通过以下的方法得以提高: 1 6 1 使用一种良 好的受体分子 提高供体和受体的浓度 降低水的活性 去除最终产品 当 使用充分的反应条件时， 大部分的糖普酶可以催化转搪昔作用 反应。 总的来看， 在各种 类型搪昔 酶催 化的 基质水解过程中 发生转糖普作用反应， 例如， 由 转化酶催 化的蔗搪水解， 由 葡搪淀 粉酶催化的麦芽糖糊精水解， 由胞 外纤维素酶催化的纤维糊 精水 解( K a n d a 等人， 1 9 8 3 ) 以 及由 纤

15、维二搪酶催化的纤维二糖水解 G u s a k o v 等人， 1 9 8 4 ) 。 在这些情况中， 转糖昔作用产 物也是该酶的良 好的 基质.当反应混合物中 的基质浓度下降时， 转搪普作 用产物被水解。 因此， 转糖昔作用产物的浓度受动态控制， 而由 逆转水 解反应得到的产物的得 率仅取决于 热动反应平衡。 2 . 1 月 一半乳糖昔酶合 成低聚半乳搪 对于用于营养目的的低聚糖的生产最近已变得越来越感兴趣( B u r v a l l 等人， 1 9 8 0 ; Y a z a w a 和T a m u r a , 1 9 8 2 ) . 尤其是现已 证明p - D 一 半乳糖基( 1 -

16、6 ) 乳糖促进 双叉 杆菌菌株的 生长( Y a z a w a 和T a m u r a , 1 9 8 2 ) 。 这种双叉杆菌的生长因子可以 通过使 用各 种A 一 半乳绪普酶 的转糖昔作用反应来产生。 转糖普作用反应的得率取决于产酶的微生物来源和乳 糖的浓度 ( M o z a f f a r 等人， 1 9 8 4 ; P r a k a s h 等人， 1 9 8 7 ) , 当使用一种6 0 % 的5 0 克/ 升乳糖溶液进行转化 时， 可以得到高达4 0 %低聚半 乳糖的合成得率( M o z a f f e r 等人， 1 9 8 4 ) , 2 . 2 用糖昔作为受 体的转搪昔作用反应 N i ls s o n ( 1 9 8 7 和1 9 8 8 ) 研究出了在有作为受体的糖昔存在情况下使用各种糖昔酶的转糖 普作用反应。 进行这些反应是为了合成在塘结合物中发现的 专门 的低聚搪结 构。 这些低聚搪 衍生物与在 专门认可机理中在自然 条件下的实验有