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1、微生物的生长及其控制,本章基本要求：掌握测定微生物生长繁殖的方法，掌握微生物的生长规律，了解影响微生物生长的主要理化因素，掌握控制有害微生物的主要方法。 本章的重点是：影响微生物生长的主要理化因素、有害微生物的控制。 本章的难点是：微生物的生长规律、有害微生物的控制。,第一节 测定生长繁殖的方法 第二节 微生物的生长规律 第三节 影响微生物生长的主要因素 第四节 微生物培养法概论 第五节 有害微生物的控制,生长微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。,几个的概念,繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量
2、增加的生物学过程。,发育从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。,个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。,群体生长群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。,个体生长个体繁殖 群体生长,群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖,由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况,测定生长繁殖的方法,生长意味着原生质含量的增加，测定生长的方法都直接或间接地以此为依据。 测定繁殖则是建立在计算个体数目的基础上。,一、微生物的纯培养 稀释平板法 划线法 单细胞挑取法 选择培养基分离法
3、,二、测生长量,三、计繁殖数,Viable cell count,1.dilute sample,1 ml,9 ml,10 100 1000 104 105 106 107,cell No./ml,2. plate out 0.1 ml,6,Inoculating an agar plate to obtain single colonies,6,Mixed culture,Pure culture,单细胞挑取法,Mixed culture,Oral swab,Swab from sole of shoe,Each colony was examined microscopically,6,6
4、,二、测生长量,干重法 将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%20%，而一个细菌细胞一般重约10-1210-13g。 该法适合菌浓度较高的样品。 举例：液体培养物中细胞浓度达到2109个/ml时，100ml培养物可得1090mg干重的细胞。,直接法,7,间接法,比浊法：原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。 特点：快速、简便；但易受干扰。,7,生理指标法,测含氮量 蛋白质是细胞的
5、主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。,其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,7,三、计繁殖数,比例计数法,血球计数板法,液体稀释法,平板菌落计数法,滤膜培养法,适于单细胞状态,直接法 血球计数板,原理：将1cm20.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。,血球计数板法,
6、适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小； （2）不易沉降。,特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。,间接法 平板菌落计数法 液体稀释法 薄膜过滤计数法,平板菌落计数法的一般步骤,3.平板菌落计数法,平板菌落计数法,技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（1520min完成操作），严格无菌操作；,注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；,适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，,误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内
7、菌体分布不均匀、以及不当操作,4.液体稀释法,薄膜过滤计数法,常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。,将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,第二节 微生物的生长规律,由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。 同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长（synchronous growth） ，进行同步分裂的细胞称为同步细胞。 同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等
8、研究的良好材料。,一、微生物的个体生长和同步生长,获得同步生长的方法：,获得同步生长的方法主要有两类：,环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。,选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。,Helmstetter-Cummings 法,原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。,步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。,二、单细胞微生物的典型生长曲线,定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线，称为生长曲线。,把
9、少量纯种单细胞微生物接种到一定体积的培养液中后，在适宜的条件下培养，如果以细胞数目的对数值为纵坐标，以培养时间为横坐标，就可以绘制出分批培养条件下微生物的生长曲线。,典型的生长曲线 （Growth curve）,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,生长曲线的制作,其它名称：停滞期、调整期、适应期,（一）延滞期（lag phase）,1.现象：菌数没增加，曲线平行于横轴。,2.特点： 生长速率常数= 0 细胞形态变大或增长 细
10、胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强 合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶 对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）,3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物,菌种 ：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；,4.影响延滞期长短的因素：,接种物菌龄 ：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；,接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）；,培养基成分：在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所
11、以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,5.认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期； 采取的缩短lag phase 的措施有： 增加接种量； （群体优势-适应性增强） 采用对数生长期的健壮菌种； 调整培养基的成分，在种子培养基中加入发酵培养基的某些成分。 选用繁殖快的菌种,在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,（二）对数期（logarithmic phase）,1.概念：指在生长曲线中，紧接这延滞期的一段细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系的时期。 又称指数期。,2.特点： 生长速率常数最大，即代时最短； 细胞进行平衡生长，菌体大
12、小、形态、生理特征等比较一致； 代谢最旺盛； 细胞对理化因素较敏感；,指数期生长的数学模型,繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1),生长速率常数（R）,代时（G）,3.影响指数期微生物代时长短的因素：,菌种：大肠杆菌 15 min；金黄色葡萄球菌30min; 结核分枝杆菌800 min ;,培养基成分：营养丰富代时短。同在37下培养，大肠杆菌 在牛奶中代时12.5 min，而在肉汤培养基中为17min.,培养温度：温度对微生物的生长速率有明显影响。,营养物浓度：一定浓度范围内影响生长速率和生长总量。,营养物浓度对微生物生长速率和产量,生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率
13、和菌体产量的营养物就称生长限制因子。,4.应用意义：,由于此时期的菌种比较健壮，是增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；,发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度；,食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期；,是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。,又称：恒定期或最高生长期,（三） 稳定期（stationary phase）,1.特点： 生长速率常数为零：新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。,积累内含物：细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。,开始合成次生代谢产物：对于发酵生产来说，
14、一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。,2.生长产量常数（Y，或生长得率，growth yield）： 概念：表示微生物产量与营养物质的消耗之间有规律的比例关系。 Y=菌体干重/ 消耗营养物质的浓度,根据生长产量常数可确定微生物对营养物质的需要量如：Y=0.5，表示要得到5g菌体，需某营养物（葡萄糖）10g。,3.产生原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 营养物的比例失调，如碳氮比不合适; 有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等） 物化条件（pH、氧化还原势等）不合适;,4.应用意义： 最佳收获时期：发酵生产形成次生代谢产物的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，
15、提高产量，措施如下： 补充营养物质（补料） 调pH 调整温度 促进了连续培养原理的提出和创建。,（四） 衰亡期（decline phase）,1.特点：,2.产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡。,“负生长”：细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”；,细胞形态多样、内含物增多：细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放；,自溶现象：因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等；,时间长：衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。,（五）丝状菌的非典型生长
16、曲线,可分为三个时期：生长延滞期，快速生长期和生长衰退期。 典型生长曲线与非典型的丝状菌生长曲线两者差别是：后者缺乏指数生长期，与此期相当的只是培养时间与菌丝体干重的立方根成直线关系的一段快速生长时期。,三、连续培养（continuous culture）,分批培养（batch culture） ：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。,连续培养（continuous culture） ：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。,理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到
