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1、全日制硕士学位论文 企鹅珍珠贝野生与养殖群体的微卫星标记及 形态学对比分析 硕士研究生 指导教师 学位类别 学科 研究方 向 培养单位 授予学位单位 论文提交日期 王永丽 王梅芳教授 农学 水产养殖 水产经济动物繁殖生物学 水产学院 广东海洋大学 2 0 10 年4 月2 0 日 A 。电 U ll ll lll l l l llI l l llllI l 0 _ 、“ 1 6 12 2 UDC S e c u r i t yP e r i o d ： ： D i s s e r t a t i o nf o rt h eM a s t e r SD e g r e e S T U D lE
2、So NM I C R o S A T E L L I T E M A R K E RA N DM o R P H o L o G I C A L C O N T R A S T I V EA N A L Y S I SO FW I L DA N D C U I 忑W 虹E DP T E R I AP E N G U l N ( R O D I N G ) U n i v e r s i t y ： 一 S u b m i s s i o nd a t e ： W a n gY o n g l i P r o f W a n gM e if a n g A g r i c u l t u r
3、e ；R e p r o d u c t i v eb i o l o g y o f a q u a t i ce c o n o m i ca n i m a l G u a n g d o n gO c e a nU n i v e r s i t y A p r i l 2 0 1 0 戗 “ B n 撕 够 h 出 “ m 代 谳 呻 莹 h u p 沁 哪 耻 广东海洋大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独直进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出晕要
4、贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意- i , J 1 , N 本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 曼毒俩 2 0 ，6 年6n Db - ；t 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制于段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“4 “ ) 作者签稆：
5、i 未两 2 0 ，。年月日 导师签名： 豆抽菇 2 0 口年，月，口日 企鹅珍珠贝野生与养殖群体的微卫星标记及 形态学对比分析 摘要 本实验以企鹅珍珠贝( P t e r i ap e n g u i nR o d i n g ) 为研究对象，首次从D N A 分子水平 和形态学水平对企鹅珍珠贝两个群体进行对比分析。 从8 5 对近缘马氏珠母贝引物中，得到2 6 对可在企鹅珍珠贝中扩增出特异条带的 引物。利用2 6 对引物对野生和养殖群体进行扩增和群体遗传学分析。2 6 个位点的平 均单个位点固定系数( F s t ) 值为0 0 4 3 4 ；平均多态信息含量( P I C ) 值为0 5
6、 6 3 8 ；野，和养 殖群体的平均等位基因数分别为3 8 和3 4 ；平均观测杂合度( H o ) 分别为0 6 2 8 6 和 0 4 6 8 5 ；平均期望杂合度( H e ) 分别为0 6 6 1 0 和0 5 5 3 9 ；S h a n n o n S 多样性信息指数 ( I ) 分别为1 1 5 3 5 和0 9 0 8 6 ；自交系数( F i s ) 分别为0 0 9 2 2 和0 0 9 3 l ，结果表明养 嫡群体的遗传多样性和近交程度虽高于野生群体，但仍表现出较好的遗传多样性。通 过引物扩增，为今后企鹅珍珠贝微卫星引物筛选起奠定作用。 以野生和养碴企鹅珍珠贝的壳长、垂
7、直壳高、腹缘壳高为自变最对壳宽性状作依 变最的相关系数、通径系数、决定系数及相关指数等，进行分析，结果表明：野= ! = i 和 养殖群体中三个形态性状对壳宽的影响程度分别为：壳长 垂直壳高 腹缘壳高、垂 直壳高 腹缘壳高 壳长，且都达到极显著( p S Ta n dS H S T S L ；c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t sb e t w e e ne a c hc h a r a c t e ra l lh a v es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( P 铰合线长 壳长，成贝的生殖腺
8、重与其贝壳的形态性状之问没有直接、必然的联系：李朝霞1 7 3 l 取7 3 只紫石房蛤，测定其壳长、壳宽、壳高、活体重，计算相关系数，采用通径分 析方法计算了以贝壳性状为自变量对活体重作依变量的通径系数、决定系数及相关指 ： 数，确定了壳高对重量性状的影响程度最大；陈蓉等【。7 4 I 对中国5 个海区的毛蚶进行形 态差异分析，结果表明，用形态参数进行聚类分析存在着误差，仅采用贝类的形态指 标还不能完全反映其地理分布特性，如能结合分子遗传学研究可能更真实地反映群体 。 问的遗传关系；高玮玮等1 7 5 】随机抽取中国及同本海域的l 龄青蛤2 4 5 个，分别对其 形态学和生产性状，采用相关分
9、析、通径分析、决定系数分析和多元州归分析方法，r - 二 讨论了贝壳各形态性状对软体部重的影响；么宗利等1 7 6 】运用3 种多元统计分析方法， 比较研究了我国青蛤5 个地理群体的形态差异；冯建彬等【7 7 J 对我陶4 种文蛤进行了形 态研究和判别分析；刘达博等【78 l 对7 个群体的蛏进行形态学分析，从1 2 个性状中筛 选出1 0 个对形念判别有意义的性状；刘志刚等l _ 7 9 】用通径分析方法对马氏珠母贝的经 济性状对体重的决定效应进行了分析，认为壳高可以作为马氏珠母贝选育的蕾要性 状，通过选育壳高可得到具有较大体霞的子代；顾志峰掣8 0 1 利用形态学数据对海南黎 安港的企鹅珍
10、珠贝养殖群体的生长情况进行分析，得到各个形状在不同生长时期- 长 速度不同。国外很多学者也分别在形态学方面对鱼、虾、贝类的形态性状、尘长参数、 体组成成分等方面的多元相关分析研刭引- 8 7 l 。 1 3 本研究的目的与意义 氽鹅珍珠1 3 1 ( P t e r i a p e n g u i n ) 属于软体动物门、瓣鳃纲、珍珠贝f j 、珍珠贝科、珍 珠贝属I 韶I ，是我凼培育海水珍珠的主要贝种，企鹅珍珠贝贝体大，生长快，执病力强， 分泌珍珠质速度快，并且贝壳比较宽厚，适合粘附较大的珠核等优点被列入海水附壳 珠培仃铺种1 8 9 , 9 0 1 。目6 存我幽的海南与粤西南部海域已逐
11、渐兴起对食鹅珍珠叭养稍。 9 介鹅珍珠贝野生与养殖群体的微p 星标记及形态学对比分析 为J ，史深入的r 解企鹅珍珠贝，很多学者在不I 一方面对其进行研究，在1 日外，主要集 中在企鹅珍珠贝的育珠、壳层珍珠质分泌以及毒素分泌等方而的研究1 9 1 拼J ；在图内研 究范l ：f 4 则涉及领域广泛，如人工育苗方面，不仅对胚胎到个体进行礁微观察，还对育 苗过程中的外界条件进行分析$ 9 , 9 6 , 9 7 J ；育珠方面，对不同季：钙插核、插核方法以及插 核后的养殖方而都进行了相应的研列9 8 叫；在分子遗传标记同：酶方而，也，l ：展了相 应的研究o o 。0 2 1 。但企鹅珍珠贝在分子
12、标记与形念学相结合方而的研究，尚末见文章 发表。 马氏珠母贝，又称合浦珠母贝( P i n c t a d am a r t e n s i iD u n k e r ) ，隶属软体动物门、瓣鳃 纲、珍珠贝日、珍珠贝科、珠母贝剧8 8 】，与企鹅珍珠贝同属于珍珠贝科，并月都足培 疔i 海水珍珠的主要母贝| 1 0 3 l 。在很多I 司内学者相继利用R A P D 技术和微卫星技术埘马 氏珠母贝进行研究，并构建马氏珠母贝9 个组织的c D N A 文库，获得很多微T J 星标记 引物I 0 4 - 1 吲。 形念学方面的研究：壳宽，作为企鹅珍珠贝附壳珠插核的，个t 要选育指标，现 在国内对企鹅
13、珍珠贝的壳宽的研究还尚属空白。通过壳宽这形态，陀状埘野， t 和养殖 企鹅珍珠贝进行分析，并且采用多元分析方法，操作简币，还一叮以n ：较矩的H 、j 问内获 得遗，f 冬多样一件的基本信息，在此甚础l ：结合分了生物学和传统遗传f 冲| I 力法，彳i 仪可 以有效的降低研究周期，还可以节约人量的人力和财力等。 借鉴在水产动物鲤、刺参、对虾、牡蛎、扇9 、鲍鱼1 5 9 6 0 1 1 0 - 1 1 3 1f 1 已订的干U I i l 近 源物利- 微。卫星标记进行扩增，快速筛选引物的实践经验，本实验借用与企鹅珍珠! J ! 较 近缘的马氏珠母贝S S R 引物对企鹅珍珠贝的野牛和养贿两
14、种群体扩增：并结合7 髟态 学对壳宽进行分析。从分子水平对企鹅珍珠贝进行遗传多样性研究足今后进行种质改 良的綦础，与形态学相结合进行研究也是企鹅珍珠贝养殖业持续健康发展的需要，将 ：一行结合进行研究小仪为企鹅珍珠贝的种质资源和优良品种的选育等提供_ f j 力依捌， 也为研究氽鹅珍珠贝野生和养殖群体现状及企鹅珍珠贝利- 质资源的保护与恢复、遗传 改良等方面做出贡献。 1 0 广东海洋大学硕十学位沦文 2 企鹅珍珠贝微卫星标记的分析 2 1 实验材料与方法 2 1 1 材料 实验用的企鹅珍珠贝 野生群体：于2 0 0 8 年1 2 月4 同取自广西涠洲岛。7 1 个，平均壳高1 2 2 0 厘米
15、， 贝龄4 龄，从中随机选取2 4 个。 养殖群体：于2 0 0 8 年1 1 月1 2 同采自广东流沙港。7 3 个，平均壳高4 6 8 厘米， 为1 龄贝，暂养到1 2 月4 同，随机选取3 6 个。 1 2 月5 同取企鹅珍珠贝闭壳肌于9 5 乙醇中固定，分别在固定后3 、1 1 、2 4 小 时换液，最后置于2 0 冰箱中长期保存备用。 2 1 2 主要仪器 E p p e n d o r f P C R 扩增仪； E p p e n d o r f 高速冷冻离心机； 电热恒温鼓J x L 干燥箱( 上海精密实验设备有限公司) ； E P S 数显水平电泳仪及多功能电泳糟( 上海天能公
16、司) ： T a n o n 凝胶成像系统；咄 2 1 3 实验试剂 配制实验母液：I M “ I r i s C I ( p H = 8 ) ，O 5 ME D T A ( p H = 8 ) ； 1 0 S D S ：1 0 0 9S D S + 9 0 0 m ld d H 2 0 ，加双蒸水定容至1 0 0 0 m l ： S T E 抽提消化缓冲液( 1 0 0 m l 配方) ：“s C l 母液5 m l ，E D T A 母液5 m l ，N a C I 约O 6 9 ，灭菌双蒸水9 0 m l ，使用f j 配制并高压灭菌： 蛋白酶K ( 1 0 m g m l ，灭菌双蒸水配制，一2 0 。C 保存) ； 饱和N a C I 溶液； 2 0 冷冻无水乙醇( 分析纯) ； 7 0 酒精( 配制方法：每7 0 m l 的9 5 洒精中加入2 5 m l 双燕水) ： 配制氯仿
