《提取基因组DNA和PCR原理讲解》由会员分享，可在线阅读，更多相关《提取基因组DNA和PCR原理讲解（72页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、外周血基因组DNA(gDNA)的提取,一、基本原理 两个总原则： 1 保持核酸一级结构的完整性 2 去除其他杂质保证核酸的纯度:去除与核酸结合的蛋白质、多糖和脂类等大分子。沉淀不需要的核酸分子。,破膜： 释放出目的核酸分子,分离： 通过酶、有机溶剂、调节pH值、离心等手段得到粗制品,纯化： 去除杂质，纯化目的核酸。,三个过程： 破膜、分离、纯化,ULtraPureTMgDNA快速抽提试剂盒,在高盐状态下，DNA纯化树脂ULtraPureTM专一性地吸附DNA;在低盐或水溶液状态下,DNA被洗脱下来,二、试剂,纯化树脂（于GN结合液中） GN结合液 漂洗液 离心纯化柱（空柱子） 无水乙醇 TE缓
2、冲液：Tris-HCl（pH7.6) Tris:三羟甲基氨基甲烷 EDTA （pH8.0)乙二胺四乙酸,三、操作过程,1、混匀全血，1ml树脂中加0.5ml全血,颠倒混匀5-6次。室温下温育3分钟，其间颠倒混匀1次，5，000rpm离心3秒，弃上清。 2、加入1mlGN结合液，悬浮上述树脂，颠倒混匀，5，000rpm离心3秒，弃上清。 3、取0.5ml漂洗液漂洗树脂两次,颠倒混匀，5，000rpm离心3秒，弃上清。,如果树脂仍然呈黄色或褐色，重复3步1-2次。 4、加入0.8ml无水乙醇,悬浮树脂,装入离心纯化柱,13,000rpm离心1分钟,倒掉乙醇,再离心1分钟,尽量除尽乙醇。 5、将纯化
3、柱套入一个干净的1.5ml离心管中，加100lTE于纯化树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置3分钟， 13,000rpm离心2分钟。,6、收集离心管中洗脱下来的gDNA，取2 l电泳 （1%琼脂糖，120V，20分钟）检测。其余-20 保存备用。 注意：离心时保持平衡。 7、紫外分光光度计测量核算的浓度及纯度。 （测A260与A280值）,实验前注意事项:,1、所有微量离心管(eppdorf)、枪头（tip）必 须高压灭菌。 2、微量移液器的使用：看清刻度、轻旋、轻放。 3、取不同的试剂、样品须更换tip。 4、纯化树脂（于GN结合液中）为灰褐色粉状 物质，静置时沉淀于瓶底，使用时要充分混匀。
4、 5、室温低于25 时，纯化树脂与GN结合液可能出 现结晶或盐析，请务必预热，完全溶解后使用。,QuickGene Mini80 与DNA全血试剂盒,一、样本抽提前仪器安装准备 1 正确安装好各个仪器配件，接上电源。 2 把试剂盒内的废液管、收集管和带膜的套管放在仪器配件的正确位置上 二、DBS试剂盒第一次使用前准备工作 1 向EDB干粉中添加3.3ml无菌水，混匀室温静置30min 2 向WDB缓冲液中加入160ml无水乙醇,三、样本处理及血液基因组DNA纯化 1. 取一新的15ml或50ml离心管，依次加入300ml EDB溶液、2ml全血、2.5ml LDB溶液 2. 上下颠倒混匀10次
5、，2500rpm涡旋震荡15sec 3. 56水浴5min 4. 加入2.5ml无水乙醇 5. 上下颠倒混匀10次，2500rpm涡旋震荡15sec 6. 将处理过的全血倒入QuickGene-610L的带膜的套管内 7. 上机，第一次抽提选择模式“DNA WHOLE BLOOD”，按“start”开始 8. 第二次抽提选择模式“INSOLUTION A”,四、测DNA浓度与纯度 五、将抽提好的DNA 立即使用或保存于-20冰箱中，按实验室说明丢弃其他管子。,PCR原理,PCR定义:polymerase chain reaction ，聚合酶链式反应.,简单的说，PCR就是利用TaqDNA聚合
6、酶对特定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合成。基本上它是利用合成的TaqDNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。,PCR的要件,一、基本原理 PCR技术是利用DNA聚合酶在体外条件下,催化一对引物之间特异DNA片段合成的基因扩增技术。包括三个基本过程：,DNA的变性(denaturation)：,在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。,解链温度（融解温度，Tm） (melting temperature)：,使50%的DNA发生变性时的环境温度。
7、DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。,增色效应： DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。,DNA的复性（renaturation)：,在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。,减色效应： 变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。,1. 常用的变性方法：, 热变性, 酸碱变性, 化学试剂变性,2. 影响复性的因素, 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快 DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 离子强度有利于复性 DNA浓度复
8、性,Tm值的估算 20bp Tm=69.3+0.41(G+C)% Tm=81.5+16.6lgM+0.41（G+C）% -500/n-0.61（甲酰胺%）,PCR的基本成分：,1 热稳定DNA聚合酶：催化模板依赖的DNA合成。 热稳定DNA聚合酶的选择：主要依据合成大片段DNA产物需要的保真度、效率及合成能力而决定。 常规PCR，TaqDNA 聚合酶是常用酶。 2 一对引导DNA合成的寡核苷酸引物： 设计目的：获得高产率的目的扩增物，抑制非特异序列的扩增。,3 脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准PCR反应体系中包含4中等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸。 4 二价阳离子：常用镁离子用于激活，适当增加镁离
9、子可减少非特异性引导。 5 维持PH值的缓冲液：室温下标准缓冲液的PH值为8.38.8之间，72时反应体系的PH值下降1个多单位，PH值接近7.2。,6 一价阳离子：标准PCR缓冲液内包含有50mmol/L KCl ，适于大于500bp长度的DNA 片段。提高KCl 浓度在70100mmol/L ，适于较短的DNA 片段。 7 模板DNA：当使用高分子量的DNA（10kb）做模板时，如用限制性内切酶先行消化（此酶不应切割靶序列）则扩增效果更好。,基本PCR中寡核苷酸引物的设计原则：,A 碱基组成：G+C含量应在40%和60%之间，4种碱基在引物中分配均匀没有多聚嘌呤或多聚嘧啶的序列，并且没有二
10、核苷酸重复序列。 B 长度：引物中与模板互补的区域应该为1825个核苷酸长度。上下游引物的长度差别不能大于3bp。 C 不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在。这种序列可形成发夹结构，如果这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地阻止寡核苷酸和靶DNA之间的复性。,D 解链温度（Tm）：两个引物的Tm值相差不能大于5，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10。保证扩增产物在每个PCR循环可有效变性。 E 3末端：3末端碱基最好是G或C，但不应是NNCG或NNGC。因为末端GC含量高可促进发夹结构的形成，还可能产生引物二聚体。 F 上下游引物的互补性：一个引物的3末端序列不允许结
11、合到另一个引物的任何位点上，避免引物二聚体的形成和扩增。,PCR温度条件的设计：,1 模板的热变性温度和时间：双链DNA模板的变性温度由其G+C含量决定。DNA分子越长，两条链完全分开所需的时间也越长。 应用Taq DNA聚合酶时，变性一般在9495下，这是Taq DNA聚合酶进行30或以上PCR循环而活力不致受到过多损失所能耐受的极限温度。,2 引物和模板DNA的复性：复性温度过高，寡核苷酸引物不能与模板很好复性，扩增效率降低；复性温度太低，非特异性DNA片段扩增增加。 3 寡核苷酸引物的延伸：常在热稳定DNA聚合酶的催化DNA合成的最适温度下进行。对Taq DNA聚合酶来说最适温度是727
12、8。,PCR反应特点,特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低,特异性强,关键：引物与模板的正确结合 引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的 合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高,PCR反应的特异性决定因素,引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性,灵敏度高,PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克 ( pg
13、=10-12 ) 量级的起始待测模板扩增到微克( ug=10-6)水平 从 100 万个细胞中检出一个靶细胞 在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个RFU (空斑形成单位) 在细菌学中最小检出率为3个细菌,简便、快速,PCR反应用耐高温的 Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广,对标本的纯度要求低,不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制
14、的DNA扩增检测,热启动PCR Touch-down PCR RT-PCR 兼并引物PCR 巢氏PCR 反向PCR 不对称PCR 原位PCR 连接酶链反应 RACE-PCR AFLP 免疫-PCR(immuno-PCR) MSP甲基化特异PCR,1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针； 基因组DNA结构功能的研究,PCR的类型,高浓度引物,低浓度引物,2)反向PCR (reverse PCR),用反向的互补引物
15、来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,未知序列,未知序列,已知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,3）多重PCR（复合PCR）,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,4）LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记, 用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分,标记引物,观察,PCR产物,5）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）,锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,6）PCR固相分析法,检测探针信号,可用于基因芯片的制作,7）原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较
