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1、中南民族大学 硕士学位论文 人胃癌SGC7901细胞培养技术及应用 姓名：方华红 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：覃瑞 20090501 中南民族大学硕士学位论文 I 摘摘 要要 以人胃癌 SGC7901 细胞为研究对象，在确定细胞生长条件和生长规律的基础 上，对 SGC7901 细胞进行了研究。 通过比较胃癌细胞 SGC7901 在 DMEM 和 RPMI1640 两种常规培养基中的生 长形态，以及流式细胞仪分析胃癌细胞 SGC7901 在 DMEM 和 RPMI1640 两种常 规培养基中的死亡率。最终确定，人胃癌 SGC7901 细胞培养于含 10%小牛血清、
2、青霉素 100 U/mL 和链霉素 1.010-4g/mL 的 DMEM 培养液中，在 37、5%CO2 的细胞培养箱内传代培养。 采用细胞计数法，绘制了胃癌细胞 SGC7901 的生长曲线，胃癌细胞 SGC7901 一般在传代 2 到 3 天可以达到对数期。 通过比较当前科研中所用的常规细胞保存方法如细胞保存液， 乙醇， NaCl 等， 对细胞保存条件进行摸索，结果表明，在室温保存 5 天时间里，市售的细胞保存 液和 0.85% NaCl 均有相当理想的保存效果。 对细胞染色体进行核型分析。结果表明，胃癌细胞 SGC7901 适宜的秋水仙素 浓度为 0.02-0.4g/mL,低渗时间在 20
3、-30min 之间， 胰酶消化时间为 1.5min 显带效 果较适宜。胃癌细胞 SGC7901 的染色体为亚三倍体，一般在 65 条至 68 条不等， 第 4、11、16、17、21、22 对共 6 对染色体类型与正常人染色体类型相比发生了 明显的变化，说明胃细胞在癌变过程中染色体具有亚三倍体化的特点。 采用MTT法、细胞核染色、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术等方法，研究了多 糖对人胃癌细胞SGC7901的影响。 结果表明， 多糖通过诱导SGC7901细胞凋亡抑制 细胞增殖， 出现了明显的DNA ladder带和凋亡小体， 并且这些作用呈浓度时间依赖 性关系。 为了进一步阐明多糖诱导SGC7901
4、细胞凋亡的分子机理， 我们利用Western blotting法检测多糖对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。研究显示，多糖浓度及处理时 间条件性的抑制Bcl-2蛋白的表达，增强Bax蛋白的表达。 关键词：胃癌细胞; 生长条件; 生长曲线; 形态学观察; DNA 保存; 核型分析; 细胞凋亡; Bcl-2;Bax 人胃癌 SGC7901 细胞培养技术及应用 II Abstract The human gastric cancer SGC7901 cells was studied based on managing the cell growth conditions and the law o
5、f growth. By comparing the cell morphology and mortality rates in the two types of conventional DMEM and RPMI1640 medium, the human gastric cancer SGC7901 cells should be cultured in DMEM medium containing 10% fetal calf serum, 100 U / mL penicillin and 1.0 10-4g/mL streptomycin, in 37 , 5% CO2 incu
6、bator. we draw the cell growth curve by cell counting method. The gastric cancer SGC7901 cells may achieve logarithmic phase in 2-3 days after passaging. To find out cell storage conditions, we compare the current methods of cell preservation, such as cell preservation solution, ethanol, NaCl and so
7、 on. Results showed cell preservation solution and 0.85% NaCl were ideal for the cell preservation, at room temperature for 5 days. Chromosome karyotype was analysed, the results showed the concentration of colchicines was 0.02-0.4g/mL, hypotonic time was between 20min and 30min, and the time of try
8、psin digestion was 1.5min. The results also showed that the number of the cells was sub-triploid, usually in the range of 65-68. In gastric cancer cells, six pairs of chromosomes have changed significantly compared with normal chromosome types, so we conclude that in the process of the gastric cells
9、 canceration it is coupled with the characteristics of sub-triploid. MTT method, cell staining, agarose gel electrophoresis, flow cytometry and other methods were used to study on how the polysaccharides affect the human gastric cancer cell line SGC7901 cells. The results showed that the polysacchar
10、ide inhibits cell proliferation by inducing cell apoptosis, coupled with DNA breakage and apoptotic bodies. In order to further clarify the molecular mechanism of apoptosis, we detected the Bcl-2 and Bax protein expression by Western blotting. Above studies showed that the effects suppress the expre
11、ssion of Bcl-2 protein, while enhance the expression of Bax protein. Key words: gastric cancer cell, growth condition, growth curve, morphology observation, DNA preservation, karyotype analysis, apoptosis, Bcl-2, Bax 中南民族大学中南民族大学 学位论文原创性声明学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用
12、的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。 对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查 阅和借阅。 本人授权中南民族大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 1、保密，在_年解密后适用本授权书。 2
13、、不保密。 （请在以上相应方框内打“” ） 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 中南民族大学硕士学位论文 -1- 第第 1 章章 绪绪 论论 动物细胞培养是从动物体内分离细胞，模拟体内的生理环境，在无菌、适温 和丰富的营养条件下，使离体细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是 细胞学研究的技术之一， 是动物细胞工程的基础(司徒镇强,1997)。 由于动物细胞培 养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢 过程、染色体的形态变化以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效 的新方法(R.I.弗雷谢尼,2008)。同时，随着现代生物化
14、学、分子生物学、分子遗传 学以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜 力，并已为世人所关注。 细胞培养具有很多优越性，但也存在一定的局限性，因此对之应有全面的认 识(兰蓉,2007)。 细胞培养的优点如下： （1）研究的对象是活的细胞。这是组织或细胞培养最重要的优点。在实验过 程中，根据要求可始终保持细胞的活力，并可长时期地监控、检测甚至定量评估 一部分。 （2）研究的条件可以人为地控制。这也是另外的实验方法如体内试验等难以 比拟的。进行体外细胞培养的实验时，可以根据需要，控制包括 PH、温度、O2 张力、CO2张力等物理化学的条件，并且可能做到很精确以及保持其相对
15、的恒定。 同时，可以施加化学，物理、生物等因素作为条件而进行实验、观察，这些因素 同样可以处于严格控制之下。 （3）研究的样本，可以达到比较均一性。取自一般的组织样本，其构成的细 胞类型含有多种，即使是来源于同一组织，也不能做到均一性。但是，通过细胞 培养一定的代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属同一类型的细胞；需 要时，并可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。 （4）研究的内容便于观察、检测和记录。体外培养的细胞可采用各种技术和 方法来观察、检测和记录，充分地满足实验的要求。如：通过倒置相差显微镜、 电视、电影等直接观察活的细胞；电子显微镜分析细胞的超微结构；同位素标记、 放射免疫等方法检
16、测细胞内物质的合成、代谢的变化等。 （5）研究的范围比较广泛。多种学科均可利用细胞培养进行研究，如：细胞 学、免疫学、肿瘤学、生化学、遗传学、分子生物学等。可供实验的组织来源众 多，包括各种动物的各类组织，可以是啮齿类动物或哺乳类动物；可以是动物的 胚胎或成体；可以是正常组织或肿瘤组织等。 人胃癌 SGC7901 细胞培养技术及应用 -2- （6）研究的费用相对较经济。由于细胞培养有可能大量提供在同一时期、条 件相同、性状相似的实验样本，因此有时可比体内试验经济得多。例如：一个需 要 100 只鼠才能得出结论的实验可能用 100 片盖玻片或几个多孔培养板而获得具 有相同统计学意义的结果。 细胞培养虽然具有很多有点，但是亦存在一定的不足。其最根本的问题是尽 管培养技术不断发展，并努力创造条件以模拟动物体内情况，但是体外培养的细 胞与体内相应者仍然存在差异，特别是分化的问题。可以说，任何细胞置于体外 培养后，其细胞形态和功能都会发生一定程度的改变。 细胞培养的缺点如下： （1）体外培养的组织或细胞与体内相应者仍然存在差
