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1、人神经生长因子对低氧环境下离体鸡胚 前脑神经细胞生长影响的研究 章建程殷 明林云胡家庆丛颖刘忠权 ( 上海海军医学研究所) 一、引言 多年来，不断有长航艇员记忆力减退、反应迟缓的临床病例。经检测发现，水面舰艇、 潜艇、核潜艇的密闭大舱，氧气的缺乏是最直接也是最重要的因素。据报道，缺氧条件下培 养的鸡胚前脑神经细胞体出现衰退和变性现象，且这种变化呈不可逆性。另报道，神经 细胞和胶质细胞混合培养时，缺氧损害会减轻，星状胶质细胞含有丰富的糖原，网此胶质 细胞由可能通过提供糖原来减轻神经细胞缺氧损伤”j 。 近年来研究表明，内源性生物活性因子对脑损伤的作用值得重视。人神经生长凶子 ( h u m a
2、nn e r v eg r o w t hf a c t o r , h N G F ) 具有促交感、感觉神经细胞。前脑基底核胆碱能神经 的存活及突起伸长作用，与机体防御机能相关，不仅对正常神经细胞有营养作用，而且在 神经系统发育和正常生理功能维持及神经损伤修复中起重要作用。到目前为L L ，尚未见 N G F 对低氧环境下培养的神经细胞作用影响的文献报道。鉴于内源性因子与一般药物相比， 在效用和减少毒副作用方面有其优越性。因此，本研究通过体外神经细胞低氧模型的建立， 观察在无胶质细胞条件下h N G F 对抗低氧所致神经细胞损害的作用，旨在进一步证实神经 营养闭子的抗脑缺氧作用，为应用神经营
3、养因子防治缺氧损伤提供实验依据。 二、研究方法 1 神经细胞培养 在无菌条件F 分离8 d 龄S KI I I 鸡胚前脑，去脑膜后切成小块，以0 1 胰蛋白酶消化 ( 3 5 。C ，3 0m i n ) 成分散的悬液细胞。细胞接种在预涂多聚赖氨酸的2 4 孔培养板内。培养 液为： 小牛血清和4 0 0m g 1 0 0m Ld D 葡萄糖的M E M ( G i b c o ) 。细胞接种浓度和培养液 体积是每孔0 A 1 0 6 细胞加5 m L 。标本在3 7 0 C ，5 C 0 2 培养箱内预培养2 0h 。按此方法可 获得较纯的神经细胞培养标本i ”。 互实验分组 分为三组：低氧组
4、，系标本置于1 L 的密闭容器内，通低氧气体( 5 0 2 ，5 C O ， 9 0 N 2 ) ，流量2 0m L m i n 。实验组，系在培养液中不J J l d , 牛血清，以1 0n gh N G F 代之， 实验条件同低氧组。对照组，系标本置于9 5 空气和5 C 0 2 培养箱内。 2 “ 4 3 实验方法 将神经细胞预培养后换新鲜培养液。然后置于实验条件下培养一定时间后，在硅微镜 下观察神经细胞生长状况、进行神经细胞计数。 4 统计学处理 在P c 机上利用S P S S W i n 9 0 统计软件进行数据分析。 三、结果 经2 0h 常氧下预培养后，可见接种的细胞已贴壁，部
5、分长出细的突起，表明生长状况 良好( 见2 7 6 页图1 A ) 。常氧下继续培养至4 8h 后，细胞聚集成簇状，密集的突起交织成 网( ! ! 图2 7 6 页1 B ) 。但4 8h 低氧处理下的神经细胞，可见其迁移停滞，胞体萎缩，表面 有空泡及碎片较多等衰退和变性现象( 见2 6 0 页图1 C ) 。同时，我们观察到，加入h N G F 表1 人抻经生长因子对低董时神经细胞存活的影响 q 检验P 0 0 5 ，+ t 检验P O 0 5 ) ，与单纯低氧条件下培养的 鸡胚前脑神经细胞存活数比较在2 4h 时有差异( 0 0 1 P 0 0 5 ) ，而在4 8h 时差异显著( P o
6、 0 1 ) 。说明h N G F 在定程度上存在着维持神经元存活和延缓衰退的功能。 四、讨论 早期研究表明“，神经细胞和胶质细胞混合培养时，缺氧损伤会减轻，因此认为，胶质细 胞可能通过提供糖原来减轻神经细胞的损伤。我们的实验设计在低糖、无血清条件下，观 察h N G F 是否能提高脑细胞的耐低氧能力。近来有实验证明，提高培养液中的葡萄糖含 量不能减轻早期未成熟的胚胎神经细胞的缺氧损害，即使是发育较成熟的脑神经细胞，含 糖( 11 3 0m g m 1 ) 或无糖条件下培养，细胞缺氧死亡的程度基本相似，所以胶质细胞通过 提供糖原以保护缺氧脑神经元的说法值得探讨。有研究指出”】，低氧损伤后，诱发
7、大鼠脑 内纹状体、海马、大脑皮层中可见N G F 的含量应激性增加。但这种变化仅用于抵抗皮层的 进一步损害，它的作用短暂而有限，不足以维持其功能，即1 i 足以改善胆碱能系统受 2 7 5 图l 常氧或低氧条件下培养的鸡胚前脑神经细胞显微照片 A2 0h 常氧下细胞贴壁生长，部分长出突起； B 常氧下4 8h 后细胞聚集成簇状： C 4 8h 低氧处理后，细胞碎裂、死亡： D 低氧、h N ( ；F 蛋白营养下，细胞长 U 突起，交织成嗣 损所导致的乙酰胆碱含量的下降。将N G F 注入新生大鼠的隔区、海马、新皮层及脑室、纹 状体，有关脑区的胆碱乙酰基转移酶( C A T ) 的活性明显升高，
8、表达量增加，其胆碱能细胞内 的C A M P 活性也明显升高。有研究表明，新生大鼠脑低氧缺血早期，脑室内给予一次N G F ， 可至少在2 4 h 内完全防止体内胆碱能系统损伤所导致的乙酰胆碱含量下降。我们的实验证 明，外源给予h N G F 蛋白，可维持脑细胞在低氧环境下的存活并保持其特有的功能，使神 经细胞长出突起。 N G F 发挥生物效应的第一步是结合到细胞膜的受体上去，目前已制备出其特异性受体。 其高亲和力受体可能与神经纤维生长和神经元存活有关，低亲和力受体可能与去甲肾上腺 2 7 6 素合成的调节有关”J 。N G F 对神经元作用的可能机理大致有以一f - - J L 方面：当N
9、 G F 与突触 前膜的相应受体结合后，神经元摄取代谢物加速，分解和合成代谢加强；N G F _ 一受体复 合物囊泡形成，囊泡结合的N G F 由微管逆向传送而被整合到细胞体；N G F 囊泡与细胞体 的膜性结构融合，其中的部分囊泡可以和溶酶体发生接触而被降解失活；N G F 转移到核 上，与核膜受体结合并直接影响核内转录过程。 体外神经细胞低氧模型的建立，为进步开展体外神经细胞有害气体环境下的功能性 研究、有害气体对神经系统影响的机制研究、以N G F 为主的神经营养因子对神经及精神性 疾患的防护作用研究打下了扎实的基础。N G F 不仅在治疗早老性痴呆症上有其积极的意义， 而且对刨伤、烧伤
10、的伤口具有促进愈合的作用，这必将对潜艇等低氧或有害气体环境F 艇 员神经行为变化的研究和其他战伤的救治研究中发挥重要的作用。 参考文献 1 颜l 矗谦，周振华季萍等缺氧对离体鸡胚前脑神经细胞牛长的影响生理学报1 9 9 2 ，4 4 ( 5 ) ：5 2 4 5 2 7 2V i b l l l s r e t hS ，H e t t i 只o i n s b e r g M D ，e t a L A s l r o e y t e sp r o t e c t c u l t u r e d n e u r o n s f r o m d e g e n e r a t i o n i n
11、d u e db ya n o x i aB r a i n R e s 1 9 8 7 4 2 Z3 0 3 3 1 1 3L e V , i n G R ，e Y AP h y s i o l o g y o f t h e n e u r o t r o # i n sA n n u R e N e u r o s c l 1 9 9 6 1 9 ：2 8 9 4 3 1 7 4 周明华，赵萌萍酶消化的人羊膜基膜对鸡胚前脑神经细胞生长的影响解剖学报，1 9 9 0 2 1 ：5 9 6 1 5 L o ) R L a c h y a n k a r M B C o n d o n P J
12、 ，e l a L R e t r o g r a d ea x o n a l t r a n s p o r ta n d l e s i o n i n d u c e d u pr e g u l a t i o no f t h e t r k Ah i g ha f f i n i t y N G Fr e c e p t o r E x p N e u r o l ，1 9 9 4 1 3 0 ：3 7 7 3 8 6 6C k o M V , H e m p s t e o d B LP 7 5a n d T r k ：a t w o - r e c e 呻s y s t e mT I N S ，1 9 9 5 1 9 ：3 2 1 3 2 6 【作者简介】章建程男t 汉，1 9 6 7 年1 1 月出牛，浙江上虞人。1 9 9 1 年毕业于第四军医大学军医系。 1 9 9 9 年第二军医大学航空、航天和航海医学专业获医学硕士学位，海军医学研究所助理研究员，从事海 军环境毒理学研究工作。发表论文1 0 余篇，主要有人神经营养因子一3 基因在大肠杆菌中的兑隆和表达 等。
