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1、中国科学技术大学 博士学位论文 人类MEKK3蛋白质PB1结构域及Mog1蛋白质的结构与功能研究 姓名：胡琦 申请学位级别：博士 专业：生化与分子生物学 指导教师：施蕴渝;吴季辉 20080501 摘要 摘要 本论文的工作重点包括：人类M A P K s 家族激酶M E K K 3 的N 端P B l 结构 域的克隆，表达，纯化并用核磁共振的方法解析了溶液中M E K K 3P B l 结构域的 结构。在结构解析的过程中，我们发现了M E K K 3P B l 中存在着有趣的脯氨酸顺 反异构现象。基于结构，我们研究了M E K K 3P B l 与其下游激酶M E K 5 的N 端 P B l
2、 结构域的相互作用。我们的另一项工作是解析了人类M o g l 蛋白的溶液结构， 并初步研究了其与核转运蛋白R a n 的相互作用。 第一章是对M A P K 信号通路家族及P Bl 结构域的一个综述。M A P K 信号通 路参与了许多生理和病理过程，其中E R K 5 信号通路是唯一由P B l 结构域介导 的M A P K 信号通路，P B l 结构域是新近发现的蛋白一蛋白相互作用结构域，它 参与了很多信号通路的传递。 第二章中，我们解析了人类M E K K 3P B l 结构域的溶液结构。M E K K 3P B l 在大肠杆菌中表达，经N i 离子亲和层析柱纯化，用于核磁共振实验。M
3、 E K K 3P B l 结构具有典型的u b i q u i t i n 1 i k e 折叠方式，包含5 段p 折叠片和2 段Q 螺旋的紧密 球状蛋白结构域。5 段p 折叠片以平行和反平行的方式排列，2 段0 c 一螺旋以几乎 互相垂直的方式排列，处于5 段p 。折叠的另一侧。整个结构中含有一个疏水核心， 对稳定蛋白结构发挥重要的作用。令我们感兴趣的是，我们在H S Q C 谱图上意外 地发现了一些强度相对较弱的峰，经过分析，我们认为M E K K 3P B l 中存在着多 种构象，且所占比例不同。在H S Q C 谱图上，越靠近P r 0 3 9 的残基，两种构象间 的化学位移差越大。
4、考虑到以上这些，我们猜测很可能是G i n 3 8 一P r 0 3 9 问肽键的 顺反异构作用造成了M E l P B1 构象的多样性。N O E 及化学位移的信息证实了 我们的猜测。这种顺反异构的现象在P B l 结构域中还是第一次发现。顺式与反式 异构体主链之间最大的差别在P r 0 3 9 所在的连接0 【1 和p 3 的G 3 7 一L 4 0 转角区域。在 顺式构象下，这一区域形成一个第六类bp 转角( V I bp - t u m ) 。反式构象下，该区 域则不属于任何典型的p 转角。主链动力学研究揭示了K K 3P B l 的p 3 伊4 转角 可能存在着毫秒到微秒时间尺度的运
5、动。然后，我们进一步研究了M E K K 3P B l 与M E K 5P Bl 的相互作用。I T C 和S P R 实验显示M E K K 3P Bl 与M E K 5P B1 的解离 常数达到了1 0 8M ，这是很强的相互作用。通过定点突变实验，我们发现了在 M E K K 3P B l 的作用界面上，不同的残基对结合的贡献是不一样的。L y s 7 作为高 摘要 度保守的残基，在M E K K 3P B l 结合M E K 5P B l 发挥了非常重要的作用。K 7 A 突 变几乎完全阻断了M E K K 3P B l 与M E K 5P B l 的相互结合。R 5 A 突变也使得它
6、们 的相互作用大幅减弱，与此相反的是，R 1 4 A 和R 7 6 A 仅仅使相互作用稍有减弱。 因此，我们认为L y s 7 和A 唱5 在M E K K 3P B l 与M E K 5P B l 的相互作用中发挥着非 常重要的作用。 第三章中，我们解析了人类M o g l 蛋白的溶液结构。M o g l 蛋白是一个1 8 6 个氨基酸的与核转运相关的蛋白。我们用大肠杆菌表达了M 0 9 1 ，经N i 离子亲和 层析柱纯化，用于核磁实验。M o g l 含有9 段p 折叠，2 段a 螺旋和2 段3 l o 螺旋。 其中7 段p 折叠以平行和反平行的方式依次排列，两段c c 螺旋分别处于这组
7、p 折叠 的前面和后面，形成夹心结构。人M o g l 与酵母M o g l 最主要的一个差别是，在 人M 0 9 1 蛋白中，1 4 6 - 1 6 4 位的氨基酸形成一个很大的l o o p 区，而在S c M 0 9 1 中相 对应的位置则是一段c c 螺旋。我们通过凝胶过滤色谱证实了M 0 9 1 可以与R 矗n 形成 稳定的复合物，然而，我们尚未确定它们相互作用的界面，这方面的信息需要进 一步的工作来确定了。 I I A b s 宅r a c t A b S t r a c t O u rw o r kf o c u s e so nt h ec l o n i n g ，e x p
8、 r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no f 如e s o l l l t i o ns t 蹦c t u r eo fh u m a nM E K K 3P Bld o m a i nb yN M Rm e t h o d 1 n 搬ep e e s s 硝 s t r I j c t u r ed e t e r m i n a t i o n ，w eh a V ef o u n da ni n t e r e s t i n gp r o l i n ei s o m e r i z a
9、 t i o ni 董l M E K K 3P B1 B a s e do nt h es t r t l c t t l r eo fM 既K K 3P Bl 。w es t u d i e di n t e f a c i o nb e t w e 雠 匿K K 3P Bla n dP Bld o m a i no fi t sd o 、v n s t r e a mM A P Kk i n a s eM E K 5 A n o 龇r 、釉戍w eh a v ec o n d u c t e di s ，s o l V i n gt h es o l u t i o ns t r u c
10、撕r eo fah u m a np f o 毫e 主nM o g l ， a n d 如r n l e rs t t l d i e di t Si n t e r a c t i o nw i t hn u c l e o c ) ，t o p l a s m i ct r a n s p o r tp r o t e i nR a n C h a p t e rl i sab r i e fr e V i e wo ft h eM A P K s i g n a l i n gp a t h w a ys u p e r f - a m i l ya n dP B l d o r n a
11、 i n 1 淞p Ks i g n a l i n gp a m w a yh a sb e c nf o u n di n V o i V e di nV a r i o u sb i o b g i c a l p l - o c e s s e sa s 、e na sp a t h o l 。g i c a lp r o c e s s e s E R K 5s i g n a l i n gp a t h 、V a yi su n i q u e a m o n g t h eM A P Ks i g n a i n gp a t h w a y si nt l a ti ti s
12、P Bl - d e p e n d e n t ，P Bld o m a i ni sa r e c e n t l yf o u n dm o d u l em e d i a t i n gp r o t e i n 巾r o t e i ni n t c r a c t i o n 。P Blp a r t i c i p a t e s 撖 m a n ys i g n a i n gp a m w a y s l nc h a p t e r2 ，w eh a V es o l V e dt h es o l u t i o ns t r u c t u r eo fh u m a
13、 nM E K K 3P Bld o m a i n 磁K K 3P B w a se x p 糟s s e di i l 嚣玩p u r i 蠡e dw i t haN i e h e l a t i n gc o i u m n ，t h e nu d f o r 套m 瓜e x p e r i m e n t S M E K K 3P B la d o p t sa 咖i c a lu b i q u i t i n _ l i k ef o l d i n c l u d e sf i w pg 娃猢d sa n d t w oa h e l i c e s r h ef i V ep
14、s 棚d sa r ea n - a n g di nat w i s t e dp a r a l e la n d a n t i p a r a l l e lp s h e e t T h e 铆oa h e l i c e sa r e a r l yo 确o g o n a lt oe a c ho t h e ra n dl i ea t t h eo p p o s i t es i d e 。ft h ep - 幽e e t T h es t m c 铷恐i ss t a b i l i z e db yah y d r o p h o b i ec o r c c o n
15、s i S t i I l go fal a 瞎en u f n b e fo f r c s i d u e s T bo u ri n t e 心s t ，t h es p e c 妇e x h i b i t Sas e to f e r o s s p e a l ( S w i 重l l r e i a 矗V e i yl o w - i n t e n s i 够 i na d d i t i o nl om em 苟o ro n e s ，勰 i n t 黻m o l e c u l a rc o n f o r m a t i o ne x c h a n g ei st h
16、eo n I yp o s s i b l ef e a s o nf o rt h e l o 舭i n t e n s 毋s i g n a l s 赫t h es p e c 锻确ec h e m i c a ls i l i 蠢d i 穗r c n e e s 甜k c l ( 的n c a m i d e sb e t w e e nt h em i n o ra n dt h em a j o rc o n f o 册a t i o n sb e c o m el a 唱e ra st h er c s i d u e s g e tm o r cc l o s et 0f e s 逾u eP r 0 3 9 1 a l ( i n g 疆e s ei n 幻c o n s i d c r a t i o n ，w eS p e c u l a t e d 专量l a t c i s 向r a n si s o m c r i z a t i o na r o u
