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1、重庆医科大学 博士学位论文 人横纹肌肉瘤细胞系PLA-802细胞受诺帝（Nordy）的作用以及 趋化因子受体CXCR4功能性表达的研究 姓名：刘斌 申请学位级别：博士 专业：外科学（病理） 指导教师：米粲 20080501 重庆医科大学博士研究生学位论文 英文缩写 A O D B i o C a 2 + i c T X C X C R D A B D M S O E R K F C S G I u ( E ) G I y ( G ) G R O h H E 脏P E S I O D 砌 L 神K M c A b M V D r a i n M T T 英汉缩略语名词对照 英文全称 a v e
2、r a g eo p t i c a ld e n s i t y b i o t i n i n t r a c e l l u l a rC 0c o n c e n t r a t i o n c y c l o p h o s p h a m i d e c h e m o k i n er e c e p t o r 3 ，3 - d i a m i n o b e z i d i n d i m e t h y ls u l f o x i d e e x t r a c e l l u l a rs i g n a l - r e g u l a t e dk i n a s e
3、 F e t a lc a l fs e r u m G l u t a m i ca c i d G l y c i n e g r o w t h r e l a t e do n c o g e n e h o u r h e m a t o x y l i ne o s i ns t a i n i n g h y d r o x y e t h y lp i p e r a z i n ee t h a n e s u l f o n i ca c i d I n t e r g r a lo p t i c a ld e n s i t y i n t e r n a t i o
4、n a lu n i t m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m o n o c l o n a la n t i b o d y M i c r o - v a s c u l a rd e n s i t y m i n u t e 中文译名 平均光密度 生物素 细胞内的C a 2 + 浓度 环磷酰胺 趋化因子受体 3 ，3 - 二氨基联苯胺 二甲基亚砜 细胞外的信号调节激酶 小牛血清 谷氨酸 甘氨酸 生长相关癌基因 小时 苏木精伊红染色 羟乙基哌嗪乙磺酸；N 2 羟乙 基哌嗪- N 2 乙磺酸 积分光密度 国
5、际单位 细胞分裂素( 丝裂原) 活化蛋白 激酶 单克隆抗体 微血管密度 分钟 3 - ( 4 ，5 - d i m e t h y l t h i a z o l - 2 - y 1 ) 一2 ，5 d i p h 噻唑蓝 E n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e m i c r o v e s s e ld e n s i t y微血管密度 重庆医科大学博士研究生学位论文 M c A b N D G A O D P B S P I I 洲S r p m S D F l $ C C T B S T E M V E G F M o n o c l o
6、n a la n t i b o d y n o r d i h y d r o g u a i a r e t i ca c i d o p t i c a ld e n s i t y p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p r o p i d i u m r h a b d o m y o s a r c o m a r o t a t ep e rm i n u t e s t r o m a lc e l l d e r i v e df a c t o r s e c o n d T f i sb u f f e r e ds a
7、 l i n e t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r 2 单克隆抗体 去甲二氢愈创木酸 光密度 磷酸盐缓冲液 碘化丙锭 横纹肌肉瘤 每分钟转速 问质细胞源性因子1 秒 T r i s 盐缓冲液 透射电镜术 血管内皮生长因子 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所里交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人
8、已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 学位论文作者签名： 日期：型篮s 呈i 生， 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学本人保证毕业高校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分
9、内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文 论文作者签名： 指导教师签名： 重庆医科大学博士研究生学位论文 人横纹肌肉瘤细胞系P L A 一8 0 2 细胞受诺帝( N o r d y ) 的作 用以及趋化因子受体C X C R 4 功能性表达的研究l 摘要 背景和目的：横纹肌肉瘤( r h a b d o m y o s a r c o m a ，R M S ) 是软组织 最好发的恶性肿瘤之一，可发生于任何年龄，恶性程度高，危害较大。 近年来，随着化疗等方法的应用和改进，R M S 的治疗得到了一定程度 的改善，但疗效仍不满意。积极探索R M S 发生发展的机理，开发新
10、的 抗R M S 药物对R M S 的防治具有重要意义。诺帝( N o r d y ) 是西南医院 病理所自行研制的去甲二氢愈创木酸( n o r d i h y d r o g u a i a r e t i c a c i d ， N D G A ) 类化合物，研究发现，N o r d y 对体内外生长的肺癌细胞A 5 4 9 和多种胶质瘤细胞以及诱发性胶质瘤具有明显的抑制增殖、诱导分化、 抑制肿瘤血管生成等多种生物学作用，提示N o r d y 可能是一种具有应 用潜力的新型抗肿瘤药物。进行N o r d y 对R M S 作用的研究，对N o r d y 的临床应用和R M S 的治疗
11、都具有现实意义。趋化因子及其受体在肿瘤 的发生发展过程中发挥着重要而复杂的作用，是肿瘤研究的一个热点。 研究表明多种R M S 细胞系均有趋化因子受体C X C R 4 的表达，但对人 R M S 的C X C R 4 蛋白表达及其功能了解尚少。本课题就N o r d y 对R M S 的作用，以及R M S 中C X C R 4 蛋白表达和功能进行了研究。 材料和方法：研究对象为2 4 例R M S 临床标本和P L A 8 0 2 细胞系( 源 1 本课题受国家“8 6 3 计划”引导项目资助( 项目编号：2 0 0 2 A A 0 0 1 0 1 0 ) 3 重庆医科大学博士研究生学位论
12、文 自腺泡性R M S ) 。第一部分：用细胞计数法测定I C 5 0 和对P L A 8 0 2 细 胞生长曲线的影响、流式细胞术检测对细胞周期、凋亡的影响、光镜 和电镜观察瘤细胞形态学和超微结构的变化及免疫细胞化学染色和 E L I S A 检测瘤细胞m y o s i n 和V E G F 蛋白的表达研究N o r d y 对P L A 一8 0 2 细胞的影响。第二部分：将P L A 8 0 2 细胞移植于裸鼠皮下建立移植瘤 模型，通过腹腔注射给予N o r d y 治疗，测量肿瘤大小变化以确定对移 植瘤生长曲线的影响；光镜和电镜观察肿瘤形态学和超微结构的影响； 免疫组化染色和图像分析
13、检测对瘤细胞m y o s i n 蛋白表达和V E G F 蛋白 表达的影响以及微血管密度( M V D ) 的影响；观察N o r d y 在2 7 m g k g 剂量范围内对裸鼠的毒副作用。第三部分：用免疫组织( 细胞) 化学 染色检测R M S 病理标本和体内外生长的R M S 细胞系P L A 8 0 2C X C R 4 蛋白表达。第四部分：用M r T 法检测C X C R 4 对P L A 8 0 2 细胞增殖的 影响、用体外随机迁移模型和4 8 孔趋化板检测C X C R 4 对P L A 8 0 2 细 胞迁移和趋化的作用、用激光共聚焦技术检测C X C R 4 对P L
14、 A 8 0 2 细 胞内C a 2 + 浓度的影响及免疫细胞化学染色和E L I S A 实验检测C X C R 4 对P L A 8 0 2 细胞V E G F 蛋白表达的影响等检测C X C R 4 功能。 结果：( 1 ) 体外实验：1 ) N o r d y 对P L A 8 0 2 细胞作用的I C 5 0 为6 9 2 3 um o l L ；2 ) 5 0 - - 一2 0 01 1m o l L N o r d y 对P L A 8 0 2 细胞生长具有明显的 抑制作用，且具有浓度时间依赖性；3 ) N o r d y 处理后细胞形态变梭长， 核质比降低，核变小，核仁变小；4
15、 ) N o r d y 处理2 4 h 后电镜见瘤细胞 线粒体嵴紊乱、断裂，空化或形成髓鞘样结构；内质网扩张，粗面内 质网脱颗粒；7 2 h 时细胞呈椭圆形或梭形；线粒体肿胀减轻，空化减少 4 重庆医科大学博士研究生学位论文 而髓鞘样结构增多；胞质内较易见到含量不等的肌( 微) 丝；偶见拟 似凋亡小体；5 ) 1 0 0um o l L N o r d y 处理P L A 8 0 2 细胞后，1 2 、2 4h 细 胞周期的G 。G ，期分别增加了1 5 1 和8 7 ，而4 8 、7 2h 时G 2 M 期 分别增加了31 7 4 和1 3 7 2 ，与对照组比较，差异具有统计学意义 (
16、P O 0 5 ) ；6 ) 1 0 0l am o l LN o r d y 处理P L A 8 0 2 细胞，1 2h 后即出现 明显的细胞凋亡峰，并随作用时间的延长而增高，与对照组比较差异 显著( P O 0 5 ) I7 ) N o r d y 处理后瘤细胞m y o s i n 蛋白表达增高，V E G F 蛋白表达降低，与对照组相比，差异具有统计学意义( P O 0 5 ) ；( 2 ) 体内实验：1 ) 1 3 5 m g k g 及2 7 m g k gN o r d y 治疗组移植瘤生长明显受 抑制( P O 0 5 ) ，抑瘤率：前者为4 7 4 3 ，后者为6 0 0 2 ；2 ) 治疗 组未出现明显药物毒副作用；3 ) 治疗组瘤细胞异型性变小，核分裂像 减少；血管减少；4 ) 电镜见治疗组瘤细胞胞质内肌( 微) 丝增多，甚 至形成横纹肌肌原纤维；5 ) 免疫组化染色显示治疗组瘤细胞m y o s i n 蛋白表达增高，V E G F 蛋白表达降低
