《实验3、ELISA.》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验3、ELISA.（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验3 ELISA,ELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）的基础是抗原或抗体固相化和酶标记的抗体或抗原，固相化和酶标记的抗原抗体仍保持其免疫活性。 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。,常用的ELISA的方法有： 间接法 夹心法 竞争法,乙型肝
2、炎二对半,乙型肝炎病毒抗原 人体产生的相应抗体 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb (HBcAg) HBcAb 大三阳 ：HBsAg，HBeAg，HBcAb阳性 小三阳 ：HBsAg，HBeAb，HBcAb阳性,实验目的： 定性或定量测定人血清或血浆中乙型肝炎病毒表面抗体（抗HBs),可用于判断乙型肝炎疫苗接种效果和乙型肝炎病毒感染的治疗效果和预后情况。,1.试剂盒（抗HBs检测试剂盒） 2.标本（血清标本1,2,3） 3.洗液（PBS） 4.吸水纸、加样枪、枪头、湿盒、 酶标仪、 37C温箱等,实验器材,实验原理： 双抗原夹心法检测人血清或血浆中的抗-HBs（一步法）。 采用纯化
3、HBsAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP进行孵育，当标本中存在抗-HBs时，该抗体与包被HBsAg结合并与酶结合物形成HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP复合物。洗去游离反应物，加入显色剂后，将有明显颜色变化。若标本中无抗-HBs时，加入底物后没有或只有很轻微的颜色变化，在一定范围内，颜色的深浅变化与标本的含量呈正比。,+,+,Ag,Ab,Ag-HRP,洗去游离反应物,底物,显色,1.标记：4人6孔，分别标空白、-对照、+对照、标本1、标本2、标本3。 2.加样：每孔加入相对应液体50ul或1d。空白孔加50ulPBS洗涤液。 3.加酶结合物：除空白孔外，每孔加50
4、ul酶结合物。 4.充分混匀，37C湿盒内孵育30min。 5.手工洗板:弃去孔内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液注满每孔，静置5秒，再弃去，拍干。如此反复5次，拍干。 6.加显色液：每孔分别加A、B液各1d。 7.混匀，37C避光1015min，观察结果。 8.必要时加上终止液后，放在酶标仪上使用OD450nm波长测定OD值。,实验方法,未加终止液前，阳性孔呈蓝色，阴性孔和空白孔无色，标本孔如呈蓝色即为阳性，颜色深浅与标本中的抗HBs量呈正比。 加终止液后，蓝色转为黄色，放入酶标仪中检测，使用OD450-492nm波长测定OD值，计算cutoff值，读数需在终止反应后10分钟内完成。 cutoff值：COV=阴性对照平均值. 标本OD值COV为阳性，标本OD值COV为阴性。阴性对照OD值低于0.05，作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。,结果判断,注意事项（略）,思考题： 利用ELISA的方法可以定量检测标本中的含量吗？设计一个方法，写在实验报告上。,
