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1、山东省医学科学院 硕士学位论文 人外周血内皮前体细胞的分离与体外培养 姓名：宋立清 申请学位级别：硕士 专业：免疫学 指导教师：汪运山 20070401 英文缩写 a n g - I b F G F B M N C D i l a c L D L E B M E C s E G F E G M e N O S E P C s E P O F B S n k 1 G - C S F G M C S F H B S S H S C s H U V E C I G F 1 K D R h 日M P 9 M N C P B M C s P B S P E C A M - 1 英文缩写 英文全称中文 a
2、 n g i o p o i c t i n - 1 血管生成素l b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r 碱性成纤维生长因子 b o n em a l T o wm o n o n u c l e a rc e l l 骨髓单个核细胞 a c e t y l a t e dl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n l a b e l e dw i t hD i l D i l 标记的乙酰化低密度脂 白 e n d o t h e l i a lc e l lb a s a lm e d i u
3、 m 内皮基础培养液 e n d o t h e l i a lc e l l s 内皮细胞 e p i d e r m a lg r o w t hf a t o r 表皮生长因子 e n d o t h e l i a lc e l lg r o w t hm e d i u m内皮细胞生长培养液 e n d o i h e l i a ln i t r i co x i ds y n t h a s e 内皮一氧化氮合酶 e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l s 内皮前体细胞 e r y t h r o p o i e t i n
4、 促红细胞生成索 f e t a lb o v i n es e r n n l 胎牛血清 f e t a ll i v e rk i n a s e - l胎肝激酶1 g r a n u l o c y t ec o l o n y - s t i m u l a t i n gf a c t o r 粒系集落刺激因子 g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g ec o l o n y - s t i m u l a t i n gf a c t o r 粒系巨噬系集落刺激因子 H a n k s b a l a n c e ds a l t s H
5、 a n k s 平衡盐溶液 h e m o p o i e t i cs t e mc e l l s 造血干细胞 h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a l C e l 脐静脉内皮细胞 i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a t o r - 1 胰岛素样生长因子 k i n a s ei n s e r td o m a i nr e c e p t o r 激酸插入区域受体 m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e 9 基质金属蛋白激酶9
6、m o n o n u c l e a rc e l l单个核细胞 p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a r c e l l s 外周血单个核细胞 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p l a t e l e t - e n d o t h e l i a lc e l l a d h e s i o nm o l e c u l e 1 血小板内皮细胞粘附分子- 1 8 R r P C R S C F S D F 1 T N F a T N F R j 2 T P 0
7、 U E A - 1 V E c a d V E G F V E G F R 2 r e v e l _ s et r a n s c r i p t - p o l y m e r a s e c h a i nR e a c t i o n s t e mc e l lf a c t o r s t r o m a - d e r i v e df a c t o r - 1 t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - a l p h a t u m o rn e c r o s i sf a c t o rr e c e p t o r2 t h r o
8、m b o p o i e t i n u l e xe u r o p a e u sa g g l u t i n i n i l v a s c u l a re n d o t h e l i a lc a d h e r i n v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a t o r v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a t o r r e c e p t o r2 v a nW i l l e b r a n df a c t o r 9 反转录聚合酶链式反应
9、干细胞因子 基质来源因子1 肿瘤坏死因子a 肿瘤坏死因子受体2 血小板生成素 荆豆凝集素1 血管内皮钙粘蛋白 血管内皮生长因子 血管内皮生长因子受体2 血管性血友病因子 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中引用 他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的 任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东省医学科学 院。山东省医学科学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权 利。本人离校后
10、发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单 位仍然为山东省医学科学院。 论文作者签名：宝兰丛 导师签名：0 互坦 吼丑上月兰日 吼五上月竺日 人外周血内皮前体细胞的分离与体外培养 摘要 背景越来越多的证据显示源于骨髓的内皮前体细胞( e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o r c e l l s ，E P C s ) 不仅参与了胚胎时期的血管生成，也参与了出生后的血管生成。在 胚胎时期，E P C s 参与了最初的原始血管形成过程，即血管发生( v a s c u l o g e n e s i s ) 。 已经证明，E P C s 也
11、存在于成人体内。E P C s 主要存在于骨髓，但可在一些来自外 周的细胞因子和血管因子信号的作用下被动员入外周血，进入组织，通过合并入 血管内皮或释放生长因子促进血管生成，即出生后血管发生。这些发现提出了一 个关于成体血管生长和发育的重要问题。血管发生在成体新血管生成中起重要作 用吗? 这个过程的损害导致疾病吗? 有大量证据显示血管发生确实是出生后新 血管形成的重要组成部分。最近，在以动物骨髓移植模型进行的研究中发现E P C s 在肉芽组织血管形成和生长因子诱导的新血管形成中的贡献比例约为5 2 5 。 最近的临床前期的研究已经显示出，输入E P C s 能够恢复肢体、视网膜和心肌在 缺血
12、发生后的血管形成。因此，自体E P C s ，无论是体内动员还是自体移植，已 经成为缺血性疾病和内皮损伤的血管生成治疗的一个主要对象。成体血管发生的 观念迅速被转化为使用培养的或体内动员募集的E P C s ，在缺血组织、伤口和受 损血管处培育新血管或代替受损的血管内皮的治疗策略。然而，在外周血中E P C s 数量少，限制了E P C s 移植和E P C s 在体外组织工程的应用。而且，到目前为止， 关于E P C s 的分子标志仍存在一些混乱，需要确定新的能够特异地定义人以及实 验动物E P C s 的分子标志。 目的本课题研究的目的在于探讨从人外周血分离、体外诱导培养内皮前体 细胞的可
13、行性，并对培养收获细胞进行分析以确定其表型和功能。以探索E P C s 分离、培养的条件，建立体外E P C s 增殖培养方法，为E P C s 移植及E P C s 在体 外组织工程中的应用打下基础。 方法我们分别用全血F i e o l l - H y p a q u e 密度梯度离心法和富集白细胞 F i c o l l H y p a q u e 密度梯度离心法从健康人志愿者外周血中分离外周血单个核细胞 ( p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s ，P B M C s ) ，对两种分离方法的分离效果进行 了比
14、较。将分离后的P B M C s 在包被有纤连蛋白的培养板上，分别在增补了胎牛 血清( f e t a lb l o o ds e r u m ，F B S ) 、血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t h f a c t o r , V E G F ) 、碱性成纤维生长因子( b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r , b F G F ) 和血小板 生成素( t h r o m b o p o i c t i n ，T P O ) 等生长因子和细胞因子的M 1
15、 9 9 - 2 0 完全培养基中和 未增补生长因子和细胞因子的M 1 9 9 2 0 完全培养基中培养。培养过程中每天用 2 倒置显微镜观察其生长情况和细胞形态变化。在培养的第6 天，进行F I T C 标记 荆豆凝集素1 ( u l e xe u r o p a e t ma g g l u t i n i n - 1 ，U E A - 1 ) 结合试验和D i l 标记乙酰化低 密度腊蛋白( a c e t y l a t e dl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n ，a c L D L ) 吞噬试验，以荧光显微镜和 扫描共聚焦显微镜观察试验结果
16、，确定粘附细胞的内皮功能。在培养的第7 天用 流式细胞分析检测粘附细胞表面C D l 3 3 ，C D 4 5 ，C D 3 4 和K D R 分子的表达情况。 C D l 3 3 表达于H S C s 和早期E P C s ，C D 4 5 是血液白细胞普遍表达的分子，而C D 3 4 和K D R 可表达于H S C s 、E P C s 和E C s ，我们用这些膜分子作为标志，以鉴别培 养收获的细胞的性质，区别内皮细胞同血液中自细胞、造血干细胞以及早期 E P C s 。 结果用全血F i c o l l H y p a q u e 密度梯度离心法和富集白细胞F i c o l l H y p a q u e 密度梯度离心法成功分离出外周血单个核细胞，而前者分离的细胞中混有红细胞 较多，两种方法比较后者有更好的分离效果。在增补生长因子和细胞因子的完全 M 1 9 9 2 0 培养液中培养后，观察到部分细胞呈贴壁粘附生长，观察到典型的内皮 细胞形态特征，如索状结构和铺路石样外观。培养6 天后，大部分细胞的F I T C 标记荆豆凝集
