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1、华中科技大学 硕士学位论文 人干扰素-2b（HuIFN-2b）基因的烟草细胞核转化及其叶绿 体定点表达载体的构建 姓名：赵稳 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：何光源 2010-05-23 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 摘 要 摘 要 干扰素具有抗病毒、影响细胞生长及增强人体免疫应答的功效，在临床上有着 广泛的应用。 人干扰素 -2b 是在生物制药中排名第三的药用蛋白。 目前由于人干扰 素 -2b 生产成本高，限制了它在许多不发达国家的广泛使用。近年来，利用转基因 植物生产药用蛋白已成为植物基因工程研究的
2、一个新热点。与传统生物反应器如微 生物和哺乳动物细胞体外培养等相比，利用转基因植物作为生物反应器具有其独特 的优势，如生产成本低、能生产出具有完整生物活性的蛋白和生物安全性好等。本 研究利用基因工程手段， 构建了人干扰素 -2b 基因的烟草细胞核和叶绿体定点整合 的表达载体，并且实现了其在烟草细胞核中的转化，所取得的主要研究结果如下： 1）成功构建了人干扰素 -2b 基因的原核表达载体 pet28a-IFN，并将其转入大 肠杆菌进行了原核表达，通过 SDS-PAGE 检测，证明了干扰素 -2b 的表达。 2）成功构建了人干扰素 -2b 基因的烟草细胞核转化载体 pBIFN，通过农杆菌 介导法的
3、烟草叶盘转化法进行了转化，获得了转基因再生植株，PCR 验证得到阳性 转化苗 35 株。 3） 成功构建了人干扰素 -2b 基因的烟草叶绿体定点整合表达载体 pCL151-IFN，即将目的基因干扰素 -2b 基因（两端分别有烟草叶绿体特异性 psbA 基因 3终止子序列和 Prrn 启动子） 插入到 pCL151 载体的两个同源片段 rbcL 基 因和 accD 基因之间；测序结果表明这些 DNA 片段序列和插入位点都完全正确。 本课题利用基因工程手段完成了人干扰素 -2b 基因的原核表达、 烟草细胞核表 达及烟草叶绿体定点整合表达载体的构建， 为进一步实现人干扰素 -2b 的烟草叶绿 体表达
4、体系奠定了基础。 关键词关键词：人干扰素 -2b，原核表达，转基因植物，叶绿体转化，载体构建 I 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Abstract Interferons have many clinical applications due to their abilities of inhibiting viral replication，cell growth and enhancing the immune response. Human interferon -2b (HuIFN-2b) ranks third in w
5、orld market use for biopharmaceutical. However, HuIFN-2b is unavailable to most patients in developing countries because of its high cost. In recent years, plant based expression system has become the hot topic of research for producing biopharmaceutical proteins for prevention or therapy in the lar
6、ge scale. Comparing to some traditional expression systems such as microbial system and animal cells, transgenic plants have many advantages. The most attractive advantage is the comparatively low cost. Besides, transgenic plants, which belong to eukaryotic organisms can produce biopharmaceutical pr
7、oteins with fully biological activity. Moreover, human can avoid the comtamination from pathogenic, oncogenic DNA sequences and endotoxins of plants. In the present research, we constructed HuIFN-2b expression vectors both for nucleus and chloroplasts intergration in tobacco，and successfully transfo
8、rmed the vector for nucleus into tobacco nucleus genome via Agrobacterium-mediated method. The main results are as follows 1）The prokaryotic expression vector pet28a-IFN for HuIFN-2b was constructed and transformed into E.coli. The expression of HuIFN-2b was comfirmed by SDS-PAGE. 2）The nuclear expr
9、ession vector pBIFN for HuIFN-2b was constructed and transformed into tobacco leaf discs via Agrobacterium-mediated method. Thirty five positive regenerated transformants were obtained . 3 ） The site-specific transformation and expression vector pCL151-IFN for HuIFN-2b in tobacco chloroplasts was co
10、nstructed. HuIFN-2b gene，which contains the transcription promoter of Prrn gene and the 3 transcription terminator of II 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 psbA gene, was inserted between two homologous fragments(rbcL and accD) of tobacco chloroplast genome to form pCL151-IFN. In conclu
11、sion, the prokaryotic expression for HuIFN-2b gene, nuclear transformation for HuIFN-2b gene in tobacoo and the construction of cloroplast transformation and expression vector in tobacco are completed. The achievements of present research has paved the way for HuIFN-2b production in transgenic tobac
12、oo, especially in chloroplasts. Key words: human interferon-2b; prokaryotic expression; transgenic plant; chloroplast transformation; vector construction III 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本
13、人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学
14、 位 论 文 1 绪言 1 绪言 1.1 干扰素（干扰素（IFNs）介绍）介绍 1.1.1 干扰素（干扰素（IFNs）概况）概况 干扰素（interferon，IFNs）是一种广谱抗病毒剂，是当脊椎动物受到病原体（例 如病毒、细菌或寄生物等）或癌细胞攻击时，由淋巴细胞分泌的一类蛋白质家族。 它们可以引起细胞之间的信号传递，从而刺激免疫系统对机体进行保护，消灭入侵 的病原体或癌细胞。第一种干扰素蛋白是 1957 年 Alick Issacs 和 Iean Lindenmann1 在用鸡胚毛尿囊对流感的干扰现象进行研究时发现的，它被描述成一种能干扰病毒 复制的具有高度生物活性的糖蛋白。 1963
15、年， Lampson 等人2对干扰素进行了纯化， 确定了其分子量为 2030 KDa。 干扰素的相对分子质量小，对热稳定，4可保存很长时间，-20可长期保存 其活性，56则被破坏，pH 在 210 范围内干扰素不被破坏。人体自然就能产生干 扰素，经一定的制剂加工过程也能制造成药物干扰素制剂。 1.1.2 干扰素的特点和分类干扰素的特点和分类 干扰素有如下一些特点：1）机体在正常情况下，干扰素浓度较低，但是当机体 收到病毒或癌细胞攻击时可以在瞬间产生大量的干扰素，从而防止病毒的复制和扩 散；2）生物活性高，1 mg 的干扰素就含有 10 亿个活性单位；3）是一种广谱的抗 病毒蛋白，对所有病毒均有
16、一定的抑制作用；4）其生物活性具有种属特异性，即 一种动物所产生的干扰素只能对同种动物的细胞发挥其抗病毒作用；5）理化性质 比较稳定。 干扰素可大致分为三类：型干扰素，型干扰素和型干扰素。 型干扰素： 所有的型干扰素都可以和一种特定的细胞表面受体复合物结合， 即 IFN- 受体（IFNAR，由 IFNAR1 和 IFNAR2 组成） ；人体中存在的型 IFN 有 1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 IFN-、IFN- 和 IFN- 3 。 型干扰素：与受体 IFNGR 结合；人体中有 IFN-。 型干扰素：与一种由 IL10R2（也叫 CRF2-4）和 IFNLR1(也叫 CRF2-12)的受 体复合物结合。型干扰素没有其他两型普遍。 每一型的干扰素都有很好的抗病毒感染的能力。IFN- 属于 IFN- 家族，其结 构和大小与其它 IFN-
