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1、武汉大学 硕士学位论文 亚低温对凝血酶引起的大鼠脑水肿、神经细胞凋亡及蛋白酶激 活受体-1 mRNA表达的影响 姓名：唐颖馨 申请学位级别：硕士 专业：神经病学 指导教师：李承晏;毛小平 20040401 摘要 蟊的；搽讨蘧低滋对大鼠脑出搬籍凝盘酶( T h r o m b i n ，T M ) 7 1 起的膝承瓣、 神经细胞凋亡( A p o p t o s i s ) 及蛋囱辩激活受体- lm R N A ( P r o t e a s ea c t i v a t e d r e c e p t o r - 1 ，P A R - 1 ) 表达瓣影响。 方淡；邋遥立体定位向大鼠籁肉( 惩状
2、核睡) 淀射凝巍懿，建立脑港窳籍凝 啦酶引起的脑组织损伤大鼠模型。分别观察常濑辩貔组、常瀑对照维、豫低溆实 验组藕媛繇滋对照缀太鬣麓零萎孛、襻缀缝戆凝亡甏分率及脑缀级P A R - 1m R N A 豹 表达水平。爝干、澄黧法测定脑水瓣耧度，用璇镬：掰啶( P 1 ) 潦色漉式缁溅仪稔 测细臌凋亡匿分率及邂射电镜溉察细胞凋亡形态，用逆转滚聚合酶链殷皮 ( 溅冲e 歉) 技术栽裘膝缀织P A R - Im R N A 静寝迭表乎。 绪聚；与常温实簸缌稿院，豫低潍实验缱大鬣脑水肿骥鼗减轻( P O 0 1 ) ， 凋亡细腮露分率明鼗降低( P O 0 1 ) ，脑组织P A R - 1m R N
3、A 表达水平降低 ( P 反0 5 ) 。 结谂：驻低溢能减辍黻出盎厝凝斑酶弓| 起鹃躺水肿秘减少神经细胞凋亡，并 减少由凝搬酶弓l 起的P A R - 1m R N A 袭达水平上调。 关键弼：贬低澈凝血酶脑水肿凋亡P A R - I m R N A A b s t r a c t o b i e c t i v e ：T oe x 讲o r et h ee f f e c t so f m i l dh y p o t h 魁m i ao nt h r o m b i n - i n d u c e db r a i n e d e m a ，c e l la p o p t o s i
4、s a n dt h e e x p r e s s i o no f P A R - l m R N A i nr a t s M e t h o d s ：T h er a tw a s p o s i t i o n e d i nas t e r e o t a c t i cf i ”d r n ea n dt h es o l u t i o nc o n t a i n i n g 1 0 r dt h r o m b mi n5 1s a l i n eW a si n j e c t e di n t ot h eb r a i nb yan e e d l eu n d e
5、 rs t e r e o t a c t i c g u i d a n c e B r a i nw a t e rc o n t e n t , r a t i oo f c e l la p o p t o s i sa n d e x p r e s s i o no f P A R - I r n R N A w e r em e a s u r e di nc o n t r o lg r o u p s ，n o r m o t h e r m i cg r o u pa n d h y p o t h e r m i cg r o u p R e s u l t s ：C o
6、 m p a r e d 诚t l lt h en o r m o t h e r m i cg r o u p , t h eb r a i nw a t e rc o n t e n ta n dt h e r a t i oo fc e l l a p o p t o s i sw e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d 玻D j ) a n dt h ee x p r e s s i o no f P A R - 1m R N Aw a s d e c r e a s e d 妒 坟黪秘i n t h em i l dh y p
7、o t h e r m i c g r o u p 。 C o n c l u s i o n ：M i l d - h y p o t h e r m i ct r e a t m e n ts i g n i f i c a n t l yr e d u c e dt h r o m b i n - i n d u c e d b r a i ne d e m aa n db r a i nc e l la p o p t o s i s ，a n dr e d u c e dt h eu p - r e g u l a t i o no f P A R - 1m R N A b y t
8、h r o m b i ni nr a t s K e y w o r d s ：M i l dh y p o t h e r m i a A p o p t o s i s T h r o m b i nB r a i ne d e m a p A 鬏* l m R N A 娃 郑薰声明 本人的学位论文是在鼯师指导下独立撰写并完成的，学位论文没有剽窃、抄袭、 逡骰等违爱学术道德、学零簸蓬窝爱投孬必，本天愿酝承撵峦瑟瑟产生的法律寇繁秘 盎律责任，特此郑重声明。 学位论文作者( 签名) 嘉耘罄 以舯牛年4 月，罗日 孳l言 脑出舡是常见的临床急症之一，致残率和死亡率高。出m 后脑组织除受_ 粗肿
9、 垂身砉袋影嚷蛰，霆焘耱震围缀缀豢会逡瑗拳嚣孛、曷部藏盘滚下骜、势经元撰痿、 神经胶暇细胞增生、炎性细胞浸润簿一系列病瑷生理变化f 1 ，2 1 。既往认为，这些 病理生理变化是由于肌肿压迫了周围脑组织的微循环，产生皿肿周围区域脑缺血 瑟致。艇蠢磅究发瑗，将全盘或瀵麟混会物注入丈鬣藏内，竣应震羧气囊突旋摸 拟占位散应都不会引起明显脑水肿，只有全血淀入才会导致明显脑水肿，选说明 在脑出胤后的继发性损伤中血肿的成分起了重簧作用。近年来的研究表明肌肿形 藏君，释羧熬菜些溪健纺蒺蓑盘滚零身豹藏分霹蕤是藏爨盘嚣继发整臻害豹秘蒺 基础 3 , 4 1 ，其中凝血酶的作用最为关键5 一。1 9 8 0 年S
10、 u z u k i 和E b i n a 7 首次摁出血 凝块的爨性作用这一概念。1 9 9 6 年L e e 等1 5 ，2 2 搬动物实验中发现，将全血域加入 凝盎酶骚复合物瓣巍浆注入大鬣蒸藤繁嚣霉诱发蘸零瓣，露将狳摔缨藏藏分瓣盘 浆或血清注入大鼠脑肉不会诱发脑水肿。如果在众血中加入特异性的凝血酶抑制 剂水蛭索，进行同样的实验，也不会出现脑水肿。这提示在脑出血后脑水肿的形 残孛凝纛薅起套重要臻雳。 凝胤酶受体( T h r o m b i nR e c e p t o r ) 属于蛋囱酶激活受体( P r o t e a s ea c t i v a t e d r e c e p t
11、o r s ，P A R s ) ，它怒一种G 蛋白偶联受体，现已知有P A R I 、2 、3 、4 四种， 箕孛P A R l 、P A R 3 帮P A R 4 交凝纛瓣活诬弼。藏濒盘后盘滚凝露遘程孛释放露夫 量凝血酶，通过与其受体结合，产缴跨膜信号传导，导致细胞内一系列生物学效 应【刖，引起继发性脑损伤，如脑水肿、神经细胞嬲亡( 主要悬凋亡性死亡t 9 i ) 等。 不羹缝织翡凝盘酶受傣不稳露，辩耱经系统嚣蠢，凝盘酶圭袋逶逶P A R - 1 起作 用。 与缺赢性脑血管疾病相比，脑蹴血的治疗手段相对较少，疗效也不尽如人意， 亚 羲溢疗法无疑开薜了一条疆霖治疗鹣薪途径。瓣蠹努逶常将低温麓
12、分为4 种不 同水平：辍度低温( 3 2 3 5 ) 、中度低温( 2 8 3 2 “ C ) 、深低温( 1 7 “ C 。2 7 ) 、 超深低潋( 2 “ C - 1 6 。0 ) 。前两者合称为亚低温。1 9 3 8 年美国神缀外科医师F a y 积 H e r m y 蓠先将亚羝瀵疲矮子l | 鑫床，麓看丈量静韵物窝疆床实簸帮证实2 8 3 3 的亚低温具有确切的神经保护作用 1 0 - 12 】，对颅脑损伤、脑缺皿、脑出血等都有 臻显懿浚疗效栗。 亚低温脑保护的机理有多方面，目前已证实的主要有：降低脑耗氧量、延缓 能量代谢的耗竭、减轻乳酸堆积0 3 1 ；保护血脑屏障【1 4 1
13、、减轻脑水肿、降低颅内 压；捧裁藤袋盘居连滚蠖毒害因子( 熬兴奁牲簧e 蘩羧【l 熨、季孛缀获、鑫由基、攀胺 类等) 的擞成和释放；抑制白三烯的生成 1 6 】；减少c a 2 + 内流，抑制M 9 2 + 水平下 斛1 7 l ；减少脑细胞结构屠白的破坏，促进缺血后凝白合成抑制的恢复，促进骚自 激酶C 溪力恢复等。缳窍关亚低瀵怼瑟窭盘镶护幸錾震懿莲戆疆究掇遵蒡不多； 本实验将导致脑跚舰继发性损鬻的关键物质凝血酶作为研究对象，观察其对 脑组织的损害作用，间时给予亚低激治疗，观察驻低温对凝瓶酶引起的脑水肿、 耪经缍藏溺亡及P A R - 1m R N A 表达承乎戆影翡，探讨萁保护终强瓿瑾纛疗效
14、。 为临床上使用亚低温治疗提供一定的理论依据。 2 材料与方法 1 实验动物 健康雄性S p m g u e - D a w e l e y 大鼠1 2 0 只，月龄2 3 个月，体重2 0 0 土2 5g ，由 武汉大学医学院实骏动物中心提供。 2 主要试铡及实验仪器 ( 1 ) 鼠凝m 酶，终浓艘2 u 4 a ，购自S i g m a 公司。 ( 2 ) 碘化薅睫( P I ) 染波，终浓度1 0 0 t g m l ；胰臻叁酶，终浓度0 2 5 ；孩糖核 酸麓( R N A s e A ) ，购自P r o m e g a 公司。 0 ) O 1 二乙基焦碳黻盐( D E P C )
15、，R N A 酶阻抑蛋白( R N a s i n ) ，购自P r o m e g a 公裁。 ( 4 ) 一涉法R N A 提敬试帮( T R I z o lR e a g e n t ) ，购自I n v i t r o g e n 公司。 ( 5 ) R T - P C R 试剂盒( A c c e s sR T - P C RS y s t e m ) ，购自P r o m e g a 公司。 ( 6 ) P A R - 1 引物由上海难物工程有限公司合成。 ( 7 ) P C Rm a r k e r ：D L 2 0 0 0 ，购自晶美生物工程青隈公司。 ( 8 ) 立体定向仪，
16、第二军医大学生产。 ( 9 ) 微璧涟榉器，上海玻璃仪器厂生产。 ( 1 0 ) E p i c sX L 垄流式细胞仪，B e c k m a n 公司产龋。 ( 11 ) 2 K 1 5 型温控离心机，S i g m a 公词产品。 ( 1 2 ) P C R 仪：G e n e A m p P C R S y s t e m2 7 0 0 型，美霆A & B 公霹产晶。 ( 1 3 ) V L 翻动凝胶成像系统，法国v L 公司产品。 3 实验方法 3 1 动物分组 S D 大鬣随机分为4 组： A 组( 常温生理盐水组) ：3 0 只，通过立体定向仪向颅内注射生理盐水5m ； B 维( 鬻潺凝盘酶缀) ：3 0 哭，遴遐立体定惠仪巍矮内注射凝癜酶5 潼( 2 峨1 ) ； C 组( 溅低温生理盐水缀) ：3 0 只，通过立体定向仪向颅内注射生理盐水5 “l 后， 亚低温保护2 4 h ： D 组( 效低温凝盘酶缀) ：3 0 只，遴避立镂定淘纹囊矮痰注菇凝囊酶5 癌( 2 u 1 9 1 ) 后，
