人外周血单个核细胞向心肌细胞分化的体外研究

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1、复旦大学 硕士学位论文 人外周血单个核细胞向心肌细胞分化的体外研究 姓名：李为真 申请学位级别：硕士 专业：内科学 指导教师：孙宝贵 20040430 复旦大学2 0 0 4 届硕士学位论文人外周血单个核细胞向心肌细胞分化的体外研究 人外周血单个核细胞向心肌细胞分化的体外研究 摘要 背景：一般认为，成熟心肌细胞属于终末分化细胞，不具备再复制分化的能力。 因此心肌细胞坏死后只能被纤维组织修复，产生心室重构、心功能衰竭。如果让 梗死的心肌长出新的心肌细胞，那么在心梗的治疗方面将产生革命性的进展。国 内外研究证实胚胎干细胞和骨髓干细胞都能在体外诱导分化为有功能的心肌细 胞，同时也有很多文章都相继报导

2、了关于骨髓成体干细胞移植治疗心梗的动物实 验，结果显示这些细胞能迁移至梗死灶，并参与形成有功能的心肌组织。但是外 周衄单个核细胞定向分化的体外实验研究未见相关报道。因此，我们假设体外直 接培养外周血单个核细胞，经过5 氮杂胞苷诱导也能够向心肌细胞方向分化。 目的：本研究从人外周血中分离出单个核细胞，直接体外培养并应用5 氮杂胞 苷诱导其分化。旨在探讨外周血中的单个核细胞经过培养诱导后是否具有心肌细 胞的特征，同时又具有干细胞的特征；试图说明诱导后的单个核细胞能够向心肌 细胞方向分化。 方法：采集人股动脉抗凝血l o 1 5 m l ，用F i c o l l 密度梯度离心法分离出单个核细 胞(

3、 M N C ) ，以含2 0 F B S 的D M E M 培养液培养于2 明胶包被的培养瓶中。细 胞黄于3 7 。C 、5 C 0 2 的培养箱中，第3 天更换为含有5 氮杂胞苷( 浓度为1 0 p m o l L ) 的D M E M 完全培养液刺激2 4 小时。对于培养所得的细胞进行心肌细胞特性以 及干细胞特性的鉴定，内容如下：1 、在细胞培养的不同时段进行形态学的观察； 2 、在培养的第1 4 天，对于所培养的细胞进行心肌细胞相关抗原的免疫细胞化学 染色，包括肌球蛋白( M y o s i n ) 、“一肌节肌动蛋白( a S a r c o m e r i cA c t i n )

4、 、结蛋白 ( D e s m i n ) 和肌钙蛋l ；l ( T r o p o n i nT ) ：3 、在培养的第1 4 天，R T P C R 检测细胞是 否表达心肌细胞特异的基因如a - M H C 和8 _ M H c 等；4 、在培养的第1 4 天，进行 C D 3 4 、A C l 3 3 流式细胞计数检测，以确定细胞是否表具备干细胞的特征；并行 c 【一S a r c o m e r i cA c t i n 流式细胞计数检测以定量分析所培养细胞的心肌细胞特征。 蛄果：每m l 外周血经F i c o l l 密度梯度离心可得到M N C 】2 X1 0 6 。相差显微镜

5、2 复旦大学2 0 0 4 届硕士学位论文人外周血单个核细胞向心肌细胞分化的体外研究 下观察，单个核细胞接种于培养板初期，贴壁细胞大多呈现圆形。在5 氨杂胞苷 刺激2 4 小时后贴壁细胞开始伸长。在培养的第1 4 天时，纺锤形细胞数量明显增 多，有聚集成簇的趋势。在培养的第1 4 天，通过免疫细胞化学染色法检测发现 肌钙蛋白T 、i l l , 一肌节肌动蛋白、结蛋白和肌球蛋白均呈阳性结果：R T P C R 结果显 示经6 - 氮杂胞苷诱导分化后的单个核细胞存在Q t - M H C ( 1 9 0 b p 条带) 和 3 - M H C ( 2 5 7 b p 条带) 基因的表达。流式细胞

6、计数分析显示，C D 3 4 阳性或A C l 3 3 阳性 率5 3 0 4 56 0 ( n = 5 ) 、a 一肌节肌动蛋白阳性率：4 2 ，7 0 1 1 3 3 ( n = 3 ) 。 蛄论：在实验中我们观察到，培养所得贴壁细胞从在大体形态方面来看，大多 呈纺锤形部分成球状或者杆状外形，与文献报道骨髓干细胞向心肌细胞分化过 程中的细胞形态类似。从免疫细胞化学染色结果来看，这些细胞表达肌球蛋白、 洳肌节肌动蛋白、结蛋白和肌钙蛋白T 这些构成心肌细胞骨架的主要蛋白。从 R T P C R 结果来看，这些细胞也已经有心肌细胞o t - M H C 和1 3 - M t - I C 的基因表

7、达。 从流式细胞计数分析结果来看，经5 氮杂胞苷诱导分化后的单个核细胞C D 3 4 阳 性或A C l 3 3 阳性率为5 3 0 4 5 6 0 ；肌动蛋白阳性率为4 27 0 士1 1 7 3 。这些培 养诱导后的单个核细胞具有心肌细胞的部分特征说明所培养的细胞在向心肌细 胞方向分化；具备干细胞的特征说明，这些细胞还具有迸一步分化的潜力。所以 我们认为直接将诱导后的单个核细胞回输体内，经过归巢作用回流到心肌组织。 在- 1 5 , 肌组织微环境中，可以进一步分化为成熟的、有功能的心肌细胞。 关铀阅：外用血单个棱细胞：心肌细胞：5 - 氮杂胞苷：心肌再生 复旦大学2 0 0 4 届硕士学位

8、论文 人外周血单个核细胞向心肌细胞分化的体外研究 I nV i t r o S t u d y o f c a r d i o m y o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o no f h u m a n p e r i p h e r a lb l o o d - d e r i v e dm o n o n u c l e a r c e l l s A b s t r a c t B a c k g r o u n d ：M a t u r ec a r d i o m y o c y t e s w a s c o m m o n l y c o

9、n s i d e r e da s t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e dc e l l sw h i c hc a n n o tr e p l i c a t et h e m s e l v e sa n ym o r e H e n c e ，t h en e c r o s i s o f c a r d i o m y o c y t e sl e a dt oaf l b r o t i ch e a l i n gi n s t e a do fr e g e n e r a t i o n ，a n dc o n t

10、r i b u t et o t h e r e m o d e l i n g a n d c o n g e s t i v e h e a r tf a i l u r e s u b s e q u e n t l y I fc a r d i o m y o c y t e r e g e n e r a t i o no c c u ri nt h ei n f a r c tm y o c a r d i u m ，t h e r ew i l lb eag r e a tb r e a k t h r o u g hi n m y o c a r d i a li n f a

11、r c t i o nt h e r a p y E m b r y o n i ca n db o n em a r r o ws t e mc e l l sw e r er e c e n t l y d o c u m e n t e dt od i f f e r e n t i a t ei n t of u n c t i o n a l c a r d i o m y o c y t e si nv i t r o a n di nv i v o H o w e v e r , t h e r ei s n or e l a t i v e r e p o r t o n c

12、a d i o m y o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o no fh u m a n p e r i p h e r a lb l o o d d e r i v e dm o n o n u c l e a rc e l l si nv i t r oI no u rs t u d y , w es u p p o s et h a t c a d i o m y o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o no fh u m a np e r i p h e r a lb l o o d d e r i v e

13、dm o n o n u c l e a rc e l l s t a k ep l a c eb yc u l t i v a t i o na n di n d u c e m e n to f 5 a z a c y t i d i n ei nv i t r o O b j e c t i v e ：T oi s o l a t eM N Cf r o mh u m a np e r i p h e r a l b l o o d ，c u l t i v a t ei nv i t r oa n d s t i m u l a t eb y5 - a z a c y t i d i

14、n e O u r p u r p o s ei s t o p r o v et h a tp e r i p h e r a lb l o o dd e r i v e d M N Cf e a t u r ea s c a r d i o m y o c y t ea n ds t e mc e l l s i m u l t a n e o u s l ya f t e rc u l t i v a t i o na n d i n d u c e m e n tT h u sw ec a nd r a wac o c l u s i o nt h a t c u l t i v a

15、t e dc e l l sa r e p r o c e s s i n g c a r d i o m y o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o n M e t h o d s ：M N C sw e r eh a r v e s t e df r o mh u m a nf e m o r a la r t e r i a l a n t i c o a g u l a n tb l o o d s a m p l e ( 1 0 - 1 5 m 1 ) b yF i c o l ld e n s i t yg r a d i e n tc e n

16、 t r i f u g a t i o n M N C sw e r ec u l t u r e dw i t h D M E M c o n t a i n i n g2 0 f e t a lb o v i n es e r u mi n2 g e l a t i nc o a t e df l a s k si ni n c u b a t o r s y s t e m ( 3 7 。C 、5 C 0 2 ) C u l t u r em e d i u mw e r es w i t c h e dt of r e s hD M E Mc o n t a i n i n 5 - a z a c y t i d i n e ( 1 0 9 m o l L ) t os t i m u l a t eM N C sf o r2 4h o u r s I m m u n o c y t o c h e m i s t r v t e s t so fm y o s i n ，a S