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1、人巨细胞病毒U L l 4 5 及U L l 3 基因 转录特点和转录本结构研究 T r a n s c r i p t i o n a lF e a t u r e sa n dT r a n s c r i p tS t r u c t u r e so f H u m a n C y t o m e g a l o v i r u s U L14 5a n dU L13g e n e s 导W i - 阮强 论文课题起止时间：至QQ 2 生鱼旦= 至Q 12 生! 旦 论文完成时间：2Q12 生! 旦 中国医科大学( 辽宁) 20 12 年5 月 中国医科大学研究生学位论文独创性声 本人
2、申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：至经日期：2 翌! 兰：五： 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导
3、师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文 论文作者签名： 指导教师签名： 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要7 二、英文缩略语o aoo oQ ooooo ooooogqo oo 1 2 三、论文 论文一人巨细胞病毒U L l 4 5 基因转录特点和转录本结构研究 前言“”“。1 3丽舌”“”“”“”“”“”“”f 3 材料与方法1 4 实验结果2 8 讨论”3 2 结论”“3 3 论文二人巨细胞病
4、毒U L l 3 基因转录特点和转录本结构研究 前言“”3 4 日日舌”“”“”“”j 4 材料与方法3 4 实验结果4 8 讨论一一”“5 2 结论一”5 3 四、本研究创新性的自我评价5 4 五、参考文献5 5 六、附录 综述“一- ”5 8 在学期间科研成绩6 8 致谢“6 9 个人简介7 0 中文论著摘要 人巨细胞病毒U L l 4 5 及 转录特点和转录本结 前言 人巨细胞病毒( H u m a nc y t o m e g a l o v i r u s ，H C M V ) 先天感染可引起新生儿多种 畸形和疾病，如黄疸性肝炎、胆道闭锁、先天性巨结肠、小头畸形、智力低下、 耳聋等多
5、器官、多系统病变。也可引起免疫低下患者( 如艾滋病患者和器官移植 患者) 的致死性感染，危害巨大。根据H C M V 先天感染致畸率和我国每年出生人 数推测，我国每年因H C M V 先天感染所致伤残儿约4 万名，给社会和家庭带来巨 大负担。H C M V 已成为感染所致先天畸形和出生缺陷的首要因素。 目前，H C M V 感染的致病机理尚不清楚。近年来，大多数学者认为病毒的自 身结构，特别是与病毒的毒力、组织细胞嗜性和与病毒逃避机体免疫能力密切相 关的病毒基因差异，可能是决定H C M V 先天感染致病机制的内在因素。 1 9 9 6 年，C h a 等对H C M V 实验室株A D l
6、6 9 株和T o w n e 株及一株命名为T o l e d o 株的临床株进行了核酸序列比较，发现临床低传代的T o l e d o 株大约有1 5 k b 的片 段( 预测编码1 9 个开放阅读框o p e nr e a d i n gf r a m e 。O R F ) 在高传代的实验室株 A D l 6 9 株中不存在，这些新序列定位于长独特序列U L 与反向重复序列b ( I R L ) 的交界区，定义为U L b 区，分别命名为H C M VU L l 3 3 、U L l 3 4 、U L l 5 1 。作 者推测，此1 9 个基因可能在病毒的复制、潜伏和对宿主的致病性方面起
7、重要作用； 其中一些基因具有编码糖蛋白的能力，推测可能在体内病毒对细胞表面病毒受体 的吸附方面起重要作用，决定病毒的组织细胞嗜性。有学者根据小鼠动物模型研 究发现T o l e d o 株比A D l 6 9 株复制水平至少高2 3 个数量级，认为可能是由于 A D l 6 9 株在细胞培养反复传代过程中出现U L b 区遗传信息的丢失，导致其毒力 和致病性明显减弱。由此可以看出U L b 区的这1 9 个新基因及其编码蛋白在 H C M V 感染的致病性方面很可能起到重要作用。 已有学者进行了有关H C M VU L b 区基因多态性及蛋白功能的研究，如 U L l 4 4 、U L l 4
8、 6 和U L l 4 7 等。临床分离株中U L l 4 4 基因呈高度多态性，可分为 3 个基因型，其编码的蛋白与肿瘤坏死因子受体具有同源性，其在单纯疱疹病毒 中的同源基因是单纯疱疹病毒( h e r p e s s i m p l e xv i r u s ，H S V ) 进入细胞的介质；U L l 4 6 和U L l 4 7 的基因呈高度多态，其编码的蛋白是趋化因子的类似物。有研究表明， U L l 4 6 编码的蛋白是中性粒细胞的诱导剂，作为趋化因子具有诱导钙动员、中性 粒细胞脱颗粒的作用。 H C M VU L l 4 5 基因是U L b 区的的1 9 个基因之一，其位于高度
9、多态性基因 U L l 4 4 和U L l 4 6 之间。2 0 0 7 年有学者对H C M VU L l 4 5 基因在先天感染患儿临床 株中的基因多态性进行研究。与相邻基因不同的是，H C M VU L l 4 5 基因在临床株 中高度保守，这种高度保守性提示其可能在病毒感染中具有重要作用。但目前尚 缺少对U L l 4 5 基因转录特点和m R N A 结构的研究。H C M V 基因组的转录过程具 有非常复杂的机制，获得H C M V 基因的转录本结构是揭示其致病机理的前提条 件，所以有必要运用分子生物学实验手段获得H C M VU L l 4 5 基因转录特点和转 录本结构。 在
10、病毒的有效感染期，H C M V 基因以一种级联形式进行表达，分别定义为即 刻早期( i m m e d i a t ee a r l y ，I E ) ，早期( e a r l y ，E ) 和晚期( 1 a t e ，L ) 。病毒的主要m 基因在病毒其它基因表达和病毒复制中起着关键作用；E 期基因编码蛋白主要参 与D N A 复制；L 期基因编码病毒的结构蛋白。U L l 3 基因位于H C M V 基因组的 U L 区。C h a m b e r s 等用D N A 芯片方法检测到U L l 3 基因在H C M V 感染的E 期表 达。D u r m 证实U L l 3 基因对于H
11、C M V 在成纤维细胞中的复制可有可无。通过对 G e n e b a n k 中检索到的H C M VU L l 3 序列进行基因多态性分析，发现该基因在临床 分离株中高度保守。然而，截至目前尚缺乏有关U L l 3 基因的转录特点和转录本 结构的研究。 本研究利用c D N A 文库筛选，N o r t h e r nb l o t 和e D N A 末端快速扩增( r a p i d a m p l i f i c a t i o no f c D N Ae n d s ，R A C E ) 实验方法，研究了H C M VU L l 4 5 基因及U L l 3 基因在临床分离株中的转
12、录特点，并获得了这两个基因转录本的具体结构，为进 一步分析其在病毒感染及致病性方面的作用提供了资料。 2 材料与方法 1 、临床分离株 用于U L l 4 5 基因及U L l 3 基因转录研究的三株临床分离株H ，C ，X 均来自 2 0 0 6 至2 0 0 7 年中国医科大学附属盛京医院住院患儿，年龄小于5 个月。临床症 状包括：巨细胞病毒性肝炎，先天性胆道闭锁，先天性心脏病，癫痫，急性支气 管肺炎等。 2 、H C M V 分离株分离培养 ( 1 ) 人胚肺成纤维细胞传代培养 人胚肺成纤维细胞分别接种到5 m l 培养管、2 5 e m 2 和7 5 c m 2 培养瓶中，分别 加入含
13、1 5 胎牛血清的1 6 4 0 培养基l m l 、6 m l 和1 2 m l ，在3 7 “ ( 2 ，C 0 2 浓度为5 的培养箱中培养7 2 小时，镜下观察细胞是否长成单层细胞。对于已长成单层的细 胞，换含2 胎牛血清的1 6 4 0 培养基维持培养：未长成单层的细胞继续用含1 5 胎牛血清的1 6 4 0 培养基培养，直至长成单层后改为含2 胎牛血清的1 6 4 0 培养基。 每7 2 小时换液一次。 ( 2 ) H C M V 分离株传代培养 取8 0 。C 冻存的毒株迅速融化后，取毒株0 2 m l 接种在已经长成单层的人胚肺 细胞培养管中，加入含2 胎牛血清的1 6 4 0
14、 培养基至l m l 。置3 7 。C 温箱中旋转培 养。每4 8 7 2 小时换液一次。每周观察细胞病变情况2 - 3 次，待细胞病变达到 7 5 1 0 0 时，用吸管将细胞吹下，8 0 “ C 冻存待用。 ( 3 ) H C M V 分离株不同感染时期样本的收集 即刻早期( I E ) 向长满单层人胚肺成纤维细胞的2 5 c m 2 培养瓶中加入放线菌酮 ( c y e l o h e x i m i d e ，C H X ) l l a l ，l 小时后将第5 代毒株接种在己加药的2 5 c m 2 培养 瓶中，感染后2 4 小时弃去培养基，加入l m lT r i z o l ，将病变的细胞吹下
