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1、江南大学 硕士学位论文 乳酸菌发酵乳抑制血管紧张素转化酶活性的研究 姓名：王宇 申请学位级别：硕士 专业：食品科学 指导教师：陈卫;田丰伟 20080601 摘要 摘要 肾素血管紧张素系统和激肽一激肽释放酶系统是两个重要的血压调控系统，血管 紧张素转化酶( A C E ) 在其中起着重要调节作用。A C E 抑制剂可有效地抑制A C E 的 活性，从而保持生物体的血压稳定。目前用于治疗高血压的一线药物都是合成抑制剂， 都有一定副作用。食源A C E 抑制肽降压效果虽然不及人工合成的A C E 抑制肽，但安 全性高，对血压正常者无降压作用，成为目前的研究热点。利用乳酸菌在生长过程中 对蛋白质的代
2、谢，使得乳酸菌发酵乳具备A C E 抑制活性，可达到安全降血压的目的。 论文比较了6 个属内1 8 种共计6 1 株常见发酵乳酸菌发酵脱脂乳后A C E 抑制率 的大小，结果表明不同乳酸菌个体间的A C E 抑制活力差异很大，乳杆菌属的A C E 抑 制活力最强，其次是双歧杆菌属，链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属和片球菌属的 A C E 抑制活力很低。乳酸菌A C E 抑制活力与其产酸能力正相关性较弱( S p e a r m a n 等级相关系数r s = 0 4 2 2 ，p 9 0m m H g 。高血压按病因分类可分为原发性高血压和继发性高血压两大 类。所谓原发性高血压，是一类病因尚不完
3、全清楚的、以体循环动脉血压升高为主要 临床表现的一种独立性疾病，这种高血压占总高血压患者的9 5 以上，是危害人体健 康的疾病之一。继发性高血压又可称为症状性高血压，这种高血压发病的病因比较明 确，是由一些已知的原因引起的。这种高血压在临床上比较少见，约占总高血压患者 的5 左右。 虽然对高血压的发病机理的研究已愈百年，但是由于其病因十分复杂，对高血压 的发病机制至今仍未有确切的认识。目前认为遗传因素、膳食调配不当、神经调节紊 乱、内分泌失调、外界环境影响及某些脏器的病变等都与高血压的发生、发展密切相 关。高血压的发病机理学说众多，其中较有代表性的有：精神神经源学说、内分泌学 说、肾源学说、遗
4、传学说、过多摄钠学说、胰岛素学说等，已知许多系统与血压的维 持有密切的关系，其中重要的有中枢神经系统、肾上腺系统、肾素一血管紧张素系统、 血管舒缓激肽激肽前列腺系统等，这些系统受内外环境的影响而变化，从而参与机 体血压的调控，多种致病因素都有可能影响以上各系统而使血压升高。 1 1 2 血管紧张素转化酶 血管紧张素转换酶( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ，A C E ，E C3 4 1 5 1 ) 是含有Z n 2 + 辅基的羧二肽酶，是一种膜结合酶，由单一6 k 链组成，分子量为1 2 9 1 0 5 1 3 6 1
5、0 5 ， 翌堕奎兰婴：生堂竺丝苎 沉降系数7 9 s ，等电点为4 7 5 ，含大量的低聚糖，能被氯离子激活并具有较宽的底物 特异性【3 7 】。A C E 最适p H 值随底物的不同而变化并受氯离子的影响，在氯离子存在 下，对于长肽底物如血管紧张素I ( a n g i o t e n s i nI ) 或缓激肽( b r a d y k i n i n ) ，A C E 最适 p H 为7 5 ；对于三肽底物如Z P h e H i s - L e u 、H i p - H i s - L e u 或H i p G l y - G l y 的最适p H 为 8。 1 1 3 血管紧张素转
6、化酶对血压的调节作用 肾素血管紧张素系统( R e n i n A n g i o t e n s i nS y s t e m ，R A S ) 和激肽激肽释放酶系 统( K i n i n K a l l i k r e i nS y s t e m ，K K S ) 是生物体调控血压的两个十分重要的系统，A C E 在其中起着重要作用( 图1 1 ) 。在R A S 中，A C E 酶起限速酶的作用，它可把无活性形 式的血管紧张素I ( A n gI ，十肽) 水解成有活性的血管紧张素I I ( A n gI I ，八肽) ，同 时钝化具有舒张血管作用的九肽舒缓激肽( B r a d y
7、 k i n i n ，B K ) ，从而使机体血压升高 【8 J 。A n gI I 具有很强的升高血压的作用，能直接兴奋血管平滑肌( 特别是皮肤、肾脏 和其它内脏的血管) ，使之产生强力收缩，提高外周阻力，从而使机体的血压升高。 另一方面，A n gI I 还可在不同的水平上兴奋交感神经，并抑制迷走神经，增强交感神 经末梢释放去钾肾上腺素，并促进其再摄取，使血管平滑肌进一步收缩，导致机体血 压的升高。而K K S 是人体内的一个降血压系统，激肽是_ 族具有促进血管舒张与降 血压作用的活性肽，是激肽释放酶作用于底物血清或淋巴液中的非活性前体物质 激肽原得到的。在血液中，激肽释放酶水解所得的产
8、物是B K ，具有舒张血管及降血 压作用。当B K 被A C E 酶作用后，A C E 酶会从B K 的C 末端切下一个二肽( P h e A r g ) 下来，变成一个没有活性的七肽，从而失去降血压作用1 8 】。 R A S 和K K S 系统在血压调节方面是一对相互拮抗的体系，其平衡协调对维持正 常血压十分重要。R A S 产生具有升压作用的A n gI I ，K K S 产生具有降血压作用的舒 缓激肽。R A S 与K K S 的平衡失调被认为是高血压发病的重要原因之一。由于A C E 在R A S 和K K S 系统中对血压调节起重要作用，抑制A C E 活性对降血压有积极的影 响，
9、所以在研发治疗高血压的药物的过程中，A C E 抑制剂成为重要抗高血压药物筛 选的靶标。 1 2 高血压病的治疗 高血压的治疗经过半个多世纪的发展，经历了许多变革。从治疗方法上，经历了 从P e e r 和S m i t h w i c k 等应用手术切除交感神经的手术治疗以及K e m p n e r 等应用稻米 和果汁进行治疗的饮食疗法，到S m i r k 用甲溴胺药物治疗的发展历程；从治疗策略上 看，也经历了单一药物治疗到联合用药，从阶梯治疗法到高度个体化的历程。可以说 高血压的治疗在方法上、治疗药物上以及观念上都取得了巨大的突破。8 0 年代以前 的降血压药物有镇静药、生物碱利血平、
10、可定乐等，他们的降压时间短且不稳定或是 有不良反应目前已很少使用。根据已知的高血压的发病原因化学合成抗高血压药物。 目前，W H O I S H 推荐的一线抗高血压药物为利尿剂、p 受体阻断剂、血管紧张素转 2 兰二垩笙堕 换酶抑制剂( A C E I ) 、钙通道阻滞剂( C a A ) 、a 受体阻断剂、血管紧张素( A n g ) 受 体拮抗剂等六大类。不同的药有不同的特点，也有一定的副作用【9 10 1 。特别是A C E 抑制剂( A C E I ) 是当今降血压药物发展最快的一种。A C E I 对各期高血压患者都有效， 不影响交感神经对血管平滑肌的调节作用，也不引起心率加快，合成
11、A C E I 主要不良 反应为易引起急性肾功能损害，贫血及粒细胞减少症，血管神经性水肿，肝脏毒性， 头痛、恶心、疲乏皮疹、蛋白尿、白细胞减少等【 13 l 。 因此，寻找天然的、安全的降血压药物引起了研究者们的极大兴趣。最新的研究 表明，在我们的日常膳食中，有多种生物活性因子对高血压有预防或治疗作用。由于 这些生物活性因子可以通过日常摄取的食物中获得，安全性高，渐渐成为高血压药物 替代品的首选。食品中生物活性因子的研究已经成为广大科研工作者研究的新热点。 肾素血管紧张素系统( R A s 系统)激肽释放酶激肽系统( K K S 系统) 血管紧张素酶( 肾素) 一激肽释放酶 ：血管紧张素I舒缓
12、激肽一前列腺煮释放 ( 无活性)( 活性) 占 l l I ) 陬司( 黜晶 血管紧张素I I L J 失活片段 l 薪弋 呒活 占( j口 蚴叮醐芦悃 9 翟品、l lI 抑制A c E 血管阻力 器鼍蒙笋【j占 血管阻力水的重吸收 l Il l jV 匹亘司匝巫妇匝巫回 图1 1 血管紧张素转化酶对血压的调节作用 F i g 1 - 1T h er e g u l a t i o na c t i o no fa n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m eo nt h eb l o o dp r e s s u r e 1 3A C
13、E 抑制肽 食物蛋白除了可以为机体提供氨基酸和能量的营养功能外，还是生物活性肽的重 要来源。一般来说，这些肽在母体蛋白序列中并不具有生物活性，经过体内( 胃肠道 3 。坚堕奎兰堡主兰垡丝奎 消化) 或体外( 食品加工过程) 的酶解可使其活性肽段释放出来，在生物体内起到了 重要的生理功能。在生物活性肽研究过程中，由于A C E 抑制肽( 具有降血压功能的 也称降血压肽) 对原发性高血压大白鼠( S H R ) 和高血压患者具有降血压作用但对J 下 常血压者无影响，所以A C E 抑制肽格外受到研究者们的关注，成为生物活性肽领域 的研究热点。 1 3 1A C E 抑制肽的结构与其活性关系 1 9
14、 6 5 年F e r r e i r a 从巴西蝮蛇( B a t h r o p si a r a r a c a ) 蛇毒罩分离出多肽物质，能增强 舒缓激肽的舒张血管作用，称为“缓激肽增强肽( b r a d y k i n i n p o t e n t i a t i n gp e p t i d e ) ”【2 】， 后来发现此类肽也能抑制A C E 而具有降血压活性【l4 1 。1 9 7 1 年O n d e t t i 等人工合成了 壬肽抗压素，是第一个应用于临床的A C E 抑制剂5 1 。人们最初从蛇毒发现的A C E 抑制肽长度一般为5 1 3 个氨基酸，大多数C 端为
15、A l a P r o 和P r o P r o ，其中 P y r - T r p P r o A r g - P r o G i n I l e P r o P r o 对高血压动物的降血压效应最强，并曾经用于体 外注射治疗高血压【l 刚，自从该肽及其降压作用发现以来，人们就以该肽作为模型药物 不断进行新的降压药物的设计，研究和生产出许多临床使用非常有效的A C E 抑制剂， 如现仍广泛使用的卡托普利。后来O n d e t t i 等人又根据A C E 底物的化学结构推测设计 出A C E 活性部位模型，并根据此模型合成了一系列口服有效的化学结构简单的小分 子A C E 抑制剂I l7
16、1 。 C u s h m a n 实验室根据竞争性抑制剂与A C E 活性的结合位点提出了模型假说【l 引， 该模型后来一直被许多研究者用来解释降压肽的作用机理。图1 2 所示就是该假设模 型。 硝瀚 摊_ 刖 l ：二二：竺= 个善。孝l L J 印誓n卤，一、聿 l m 卜c 焉捧皋卜墨。帏强稚钧 。岛蔓k I H 蓦墨抑翻棚 k 熹卜建，哪莹。莹。 图1 - 2 降压肽的作用机理假设模型 F 培l - 2T h eh y p o t h e s i sm o d e lo fa n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e se f f e c tm e c h a n i s m 模型中的六角缺I S I 是羧肽酶的活性点，表示酶的疏水袋。A C E 的环形缺口表示底 物和竞争性抑制剂的取代基R 1 和R 2 与A C E 作用
