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1、人R B 9 4 基因重组腺病毒表达载体的构建及扩增 李递王芹岳井银穆传杰唐卫生 ( 中国医擘科学院巾圈协和嚣科大学放射医学硪究所，炎簿3 0 0 1 9 2 ) 辆要；目的：构建携带入R b 9 4 罄陶的煎赡艨辅礴簸体并扩增，为研究R h 9 4 蕊剿一墩射治疗脖掰奠寇鏊础。方法； 将恐掏建耔的螨撵T R “1 - R b 9 4 穿梭质粒与稼满毒表达载悸( p d C 麓V V 5 - 1 E S T “) 避褥脯藏缀，桶建禽R h 9 4 蒸 因的璐辫簿毅体( A d - R b 9 4 ) 。A d - R b 9 4 谯滕质体的作掰下转袋翱融绸服避舒犷弹 潮鍪爨组骧病毒簸辍。雁P
2、c R 方法对辅礴戮宓翻T C I D 。拣测定敦滴艘。缝巢：构建的镦缀骧熊毒载体禽谢r b 9 4 撼阑。崩簿的滴壤为1 6 1 0 * p f u n t l 。路论；成翡构建携带人R b 9 4 蒸潮的藏组腺病海羲选载律。 荚键谲：蒸因治疗；R b 9 4 纂嘲；骤然毒褒遮戳体；煎缀技术 C o n s t r u c t i o na n dA m p l i f i c a t i o no fR e c o m b i n a n tR b 9 4G e n e A d e n o v i r u sE x p r e s s i o nV e c t o r W A N G Q
3、i l l ，L IJ i n , Y U EJ i n g y i n , M UC h u a n j i e ，T A N GW e i s h e n g ( 1 n s t i t u t eo f R a d i a t i o nM e d i c i n e , C h i n e s e A c a d e m yo f M e d i c a lS c i e n c e sa n dP e k i n gU n i o nM e d i c a l C o l l e g e , T i a n j i n3 0 0 1 9 2C h i n a ) A b s t r
4、a c t ：O b j e c t i v eT oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n tR b 9 4 辫m ea d e n o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o ra n de x p l o r e at h e r a p ya p p r o a c hf o rt u m o r su s i n gR b 9 4g e n ew i t hr a d i a t i o n M e t h o d sT I ec o n s t r u c t e ds h u t t l e v e
5、c t o rp E N T R I A R b 9 4a n da d e n o v i m sv e c t o rp A d C A n ， ，、，5 一D E S TW S Br e e o m b i n o db yL Rt e c h n i q u e t oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n e dR b 9 4g e r 埒a d e n o v i m se x p r e s s i o nv e c t o r ( A d R b 9 4 ，1 1 l ea d e n o v i m ss t o c k w a sp r
6、o d u c e db yc o t r a n s f e c t i o no f2 9 3 Ac e l l sw i t hA d - R b 甜a n dl i p o f e c t a m i n e ，T h ei d e n t i f i e a t i o no f r e c o m b i n a n te x p r e s s i o nV e C t O rw a sp e r f o r m e db yP C Rm e t h o da n dt h et i t e rw a sm e a s u r e db y T C I D 5 0 R e s u
7、 l t sT h er e c o m b i n a n ta d e n o v i m sv e c t o rc a ne x p r e s sR b 9 4g e n e 。确ea d C n o v i m st i t e rw a s 1 6 x10 S p f u m i 。C o n c l u s i o nT h er e c o m b i n a n tR 酾1 4g o n ea d e n o v i m se x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t r u c t e d s u c c e s s t u l
8、 l y - K e y w o r d s ：g e n et h e r a p y , R b 9 4g e n e ) a d e n o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o r , r e c o m b i n a t i o n 人R b 藻嘲( 视湖膜母细胞瘸基因，R c t i n o b l a s t o m ag c 腿) 憋缀早觉隆出来的人类肿瘤搠制基因1 1 1 能 卡人类1 3 譬狳色体q 1 4 部僚，m R N A 为4 6k b ，编码凼妮8 个氮基酸组成的磷酸薮囱，分子量必 1 1 0 k D “ P R b l l
9、 0 ) ，燕要功陡是参与细胞周期调控、促进细胞分化釉控翻纲臌增殖锋。R b 基因的缺失和突 变将弓I 超纲魏笼黻嫩妖和繁黢，进耐嚣致胂瘪的发隶。R b 9 4 赫因是R b 熬阁的一部分，p R b 9 4 ( 野乍型全 跃p R b l l 0 的N H 2 宋溺缺必1 1 2 个氨基酸残纂) 在不同种类肿瘤缨胞的检测中舆材比p R b l l 0 更强的肿瘤 俸套简介：搴避。狲，剐研究鼷。研巍方向：瓣瘸分乎嫩物擘。巾潦环境诱燮嗣举龛。 基金璎目：泛津箍翻然科拳蕊鑫资助瑷隧( 编譬：0 5 Y F J M J C l 2 1 0 0 ) ，鼹容囱然科举麓惫嶷黔项嗣鳊譬；3 0 7 7 0
10、6 3 8 ) 。 抑翻效瘟，其在黜卜乒肿瘸绷胞中的半寝期为1 2 小时，比p R b l l 0 长3 储，在生获受抑制秘谶分化的肿瘤 细腱内黼蠢p R b 9 4 畿自的积鬃。在以R b 9 4 为靶基因的抗肿赭基因治疗蟒究中发现，R b 9 4 基因对多种种 瘸均有抑镧作刚强3 、4 1 ，近年来。宥人将放疗岛瘸毒介导赫因治疗联会使用，肖明显的棚增强睁划的作用。 为了深入开鼹R b 9 4 蒸翔联合辐射治疗胖瘸的研究，宵必覆蒜乎蝴耩因液选腋被特别憝褥效裘达须粒的 构建。书研究来嗣p A d 洲V 5 。D E S T T M 淡达载体，构建禽有R _ b 9 4 熬阑的蘸攘腺病褥载体(
11、A d - R b 9 4 ) + 为研究R b 9 4 熬剡放射治疗舯瘤奠定熬础。 1 材料 p E N n 髓I A - R b 9 4 质粒为奉糍构建( 本塑 ；i 存) ，人腌瞥2 9 3 A 细胞、G a t e w a y 噼L RC l o n a s e T ME n z y m e M i x 、袭：迭载体p A d C M V N 5 D E S T 粼和滕质体转凝试制L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 ( 均翔夔鼷I n v i u o g c n 公润) ， 蹴感受森T O P l 0 霉日A 塑趣纯质粒大爨快速提取试剜盒( j 匕京博犬
12、器党公司) ，D M E T d ( G I B C O 公司) ，P C R 扩增仪( 獒囡T h e r m o 公司) ，凝胶电泳图像处理系统( 夔因B i o - R a d 公司) 。 2 方法 2 。1 构建p A d C M V V 5 ，D E S T - R b 9 4 重组腺镔毒载体 将p E N T R T M l A 。R b 9 4 穿梭质藕穆p A d C M V N 5 - D E S T 棚腺瘸毒表达载体遴褥己R 鞭娥，襄温下湛匀如 下成分：窍梭质粒2 u l ，糠瘸簿栽体l u l ，L Rb u f f e r2 u l , T Eb u f f e r (
13、 P H 8 0 ) 3 u i ，2 s 漩霄I8 小时。取2 - 3 u l 重组体 系转化T O P l 0 火肠杆菌，先用A m p 壤养扳筛选。然话硐飙襟索嫱养扳筛选阳性克隧并扩增。羽质独提取 试翔窳抽掇。 2 2p A d C M V N S D E S T - R b 9 4 载体的鉴定 用提取的质糙为横扳，以R b 9 4 基因上游引物( 5 * 棚T C G1 孵A C Tr 队C T GA G CT A C 岛3 ) 耨下 游弓I 物5 - - G G TT A TC A G G A CT C CC A CT C r A - 3 ) 遥行P C R 扩增。反感条件为：9 4
14、 整性3 0 s ，5 8 遐火3 0 s ，醐延种3 5 r a i n ，戴3 0 个簇环，扩增产物经O ，7 的琼脂糖凝胶电泳整定。 2 3 重组臆病毒的扩增 将P a cl 酶切潲化的燕缀质敉硐脂暇体2 0 0 0 转染7 0 汇合盼2 9 3 A 细胞。转染霸约l O 1 4 天出现病毒 空斑，待8 0 结瓤嗷发生病变效威瑟收集缨胞，予。8 0 3 7 反复冻融3 次，离心收檠点清，获褥糨制腺藏 髯溶胞产物。取狂制脓瘸簿游胞产物以I ：1 0 的比例转染8 0 汇合的2 9 3 A 细胞，2 3 天褥细胞发生绢变后。 按上述操作I l 殳获瘸毒液，获得磁滴度的菰病蠹颗糙。 2 4 重
15、组艨病毒豹滴度测定 滴度测定采用T C I D ，o ( 5 0 f l t 织培莽辫染剂爨) 栩，其基础憝鹿甩辍黻稀释法使2 9 3 A 细胞出现瘸变 从而计算滴度。 2 5 重组腺病毒转染摹E 腺癌细胞盾R b 9 4 基因的鉴定 将5 M 0 M C F 7 细胞接种予6 孔板中，以1 0 0M O I A d - R b 9 4 转染M C F 。7 细胞。4 8 h 尉提取细漉D N A ， 经P C R 扩增检测R b 9 4 熬阂。以来加A d - R b 9 4 的毳腺癌纲施为对照。 3 结果 3 1 重组朦病毒表达载体的鉴定 爨组艨媚簿表达羧体构建完成后，以此为模掇经P C
16、R 搽定，扩增出R b 擘4 基因靖段( 2 7 7 4 b p ) ，见阁 1 ，与理论缓致，袭明燕纽羧体遴有R b 9 4 麓阂。 2 _ 薹 圈l 重组腺病毒裹达载体的P 啸鉴定电泳圈 1 、= 邋为小者H 吣1 挂的窄腺铀前姨件为模扳，没有扩增P 物3 ，4 道为舍R h 9 4 堪B l 的脾璃毒敷悼为攘蚯扩增P 物为 2 7 7 I 岫。 32 重组腺病毒转染乳腺癌细胞后的R b 9 4 基因鉴定 从阁2 可以看到求转染重组腺病毒的乳腺癌细胞中没冉州蜡m 片段而转染r 重组棘病毒的乳腺癌细 胞巾】靠增H I 丁相麻的R b 9 4 蘩醐H 段。表明腺病毒舟导的外源性R b 9 4 璃降】订敬转染r 乳腺癌细胞。 团2A d R b 9 4 转染乳腺癌细胞后的P C R 鉴定电泳圈 】道术转粜蓝 l l 醵璃毒，2 道转染羞组晾辐毒 33 重组腺病毒转染2 9 3 A 细胞的形态 最组腺病毒转染
