《禾本科植物叶片表皮气孔观察的样品制备方法改良》由会员分享，可在线阅读，更多相关《禾本科植物叶片表皮气孔观察的样品制备方法改良（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、植物生理学通讯 第 46 卷 第 4 期 , 2010 年 4 月 395收稿 2009-11-24 修定 2010-02-25资助 国家 863” 计划 (2006AA100221) 、 国家科技支撑计划(2009BADA3B-03-08) 、 中国科学院创新方向性项目(KSCX2-YW-N-004) 、 中国科学院创新方向性项目(KSCX2-YW-N-042-01) 、 国家自然科学基金(30870411) 和国家 十一五 ” 科技支撑计划 (2008BA-D95B13-04) 。* 通讯作者 (E-mail: ; Tel: 0311-85871562) 。禾本科植物叶片表皮气孔观察的样品
2、制备方法改良师长海 1,2 , 李玉欣 1,2 , 董宝娣 1 , 乔匀周 1 , 刘孟雨 1,*1 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心农业水资源重点实验室 , 河北省节水农业重点实验室 , 石家庄 050021;2 中国科学院研究生院 , 北京 100049提要 : 对现有的禾本科植物叶片气孔观察的样品制作方法中的不足作了一些改良。 改良后的方法操作简便、 耗时少、 样品制备成功率高 , 且放大后的效果好 , 不会造成气孔形态的改变。 改良方法适用于禾本科植物和其他叶肉紧实不易剥离的植物叶片。 50% NaClO 处理 3 min 最适用于小麦旗叶表皮样品的制备。关键词 : 禾
3、本科植物 ; 叶片表皮 ; 气孔观察An Improving Method of Sample Preparation for Epidermis Stoma Observa-tion of Gramineous Plants LeavesSHI Chang-Hai1,2, LI Yu-Xin1,2, DONG Bao-Di1, QIAO Yun-Zhou1, LIU Meng-Yu1,*1Key Laboratory of Agricultural Water Resources & Hebei Key Laboratory of Agricultural Water-Saving, Cen
4、ter for AgriculturalResources Research, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Shijiazhuang 050021, China;2Graduate School, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, ChinaAbstract: The method of sample preparation for epidermis stoma observation of gramineou
5、s plants leaves wasimproved. The improved method was easy to operate, timesaving. It also had high success rate, and kept thegood shape of stoma after enlarged. The improved method was applicable to gramineous plants and other leaveswith compacted mesophyll. The treatment of 50% NaClO for 3 min was
6、best for obtaining epidermis sample ofwheat boot leaf.Key words: gramineous plants; leaf epidermis; stoma observation气孔是高等植物叶片调控光合作用和蒸腾作用的结构 , 气孔特性是植物生理学、 生态学和农业基础研究中的一个内容 , 而且叶表皮性状在植物分类学和系统学中也有一定价值 ( 马清温等 2005; 吉春容等 2008; 袁莉民等 2006; 赵秀琴等 2003; 郑淑霞和上官周平 2005) 。 除徒手刮制法外 , 植物叶表皮细胞和气孔形态的研究方法主要有印迹法、 撕取法
7、、 透明胶带粘取法、 透明胶带刮制法及恒温离析刮制法等 ( 陈佰鸿等 2004; 段云峰等 2008; 张守仁和高荣孚 1999; 温洁 1995; 张秀芳等 2002) 。徒手刮制时 , 重则容易将叶片刮破 , 轻则容易残留叶肉 , 对操作技术要求较高 , 且适用范围有限 , 而其优点是能够较好的保持叶片表皮的原状。 印迹法是将火棉胶、 指甲油、 牛皮胶等涂在叶片表面 ,待胶液风干后 , 撕取胶膜作为观察材料 , 此方法操作简单快速 , 但有存在胶膜不易撕取 , 风干和撕取时易变形 , 受禾本科植物表皮毛的影响膜上印迹不易辨认等问题。 撕取法和透明胶带粘取法也有简单快速的特点 , 但只适用于
8、部分表皮易撕离的植物材料 , 对表皮与叶肉结合紧密的禾本科植物几乎不能撕 ( 粘 ) 取理想的观察材料。 胶带刮制法则由于叶肉刮除不彻底和胶带自身透明效果差而影响观察。 常规离析法需要恒温处理 2448 h, 即使改良的方法也需要 1.56 h, 由于离析时间的长短不一而不易把握 , 且易导致离析不彻底 , 或腐蚀叶片表皮 , 操作繁琐。 本文中改良的禾本科植物叶片观察法有操作简单快速和容易获得理想的观察材料等特点。技术与方法 Techniques and Methods植物生理学通讯 第 46 卷 第 4 期 , 2010 年 4 月396材料与方法1 改良的原理初步刮制可促使 NaClO
9、与残余叶肉充分接触 ,加速叶脉和叶肉的离析漂白。2 材料与用品植物材料为生长条件一致的灌浆期大田冬小麦 ( Triticum aestivum L.) 旗叶中部 , 取样后立即用标准固定液 ( 福尔马林 - 冰醋酸 - 酒精混合固定液 ,FAA) 固定。操作用品有 : 普通剃须刀片、 镊子、 盖玻 片、载玻片、 胶头滴管、 吸水纸、 蒸馏水、 不同浓度 NaClO 、 秒表。3 试验方法3.1 改良刮制法的操作流程 (1) 初步刮制 : 剪取经FAA 固定的小麦旗叶中部片约 2 cm, 目标表皮朝下置于平整的小操作平台 ( 可用盖玻片包装盒或载玻片代替 ) 。 加 12 滴蒸馏水 , 用刀片顺
10、叶脉方向刮去上面的表皮和大部分叶肉 , 刮制时刀片竖直 , 用力均匀。 (2) 快速离析 : 在经过初步刮制的叶片上加12 滴 50% NaClO ( 以浸润整块材料为宜 ) 。 静置约 2 min ( 视植物材料和初步刮制的情况而定 ) 待叶肉变白。 (3) 二次刮制 : 用蒸馏水冲洗掉离析液 , 加12 滴蒸馏水 , 再将剩余的叶肉刮掉。 (4) 转移 : 再一 次用蒸馏水冲洗刮制完成的叶片 , 截去过多的部分 , 将载玻片贴压在刮好的材料上 , 依靠水的吸力转移到载玻片上 , 转移以后目标表皮外侧朝上可以直接加盖玻片观察 , 染色后观察 , 或脱水后做成永久样品。 操作过程中应注意保持材
11、料的湿润。3.2 改良方法的优化 优化方案设 25% 、 50% 和75% 3 个浓度水平的 NaClO 处理 , 1 、 2 和 3 min 的处理时间 , 共 9 个处理。 按照上述操作流程 , 初步刮制后的叶块 ( 冬小麦灌浆期旗叶中部 ) 滴加 NaClO,使叶块完全浸没 , 立即计时。 处理结束时立即用吸水纸吸去残液 , 然后加蒸馏水 , 进行二次刮制。 做成临时装片后在 Zeiss Axioplan 2 imaging MOT 生物显微镜下放大 200 倍观察并拍照。3.3 改良法可靠性验证方法 分别将由最优改良方案 (50% NaClO 处理 2 min) 和传统徒手刮制得到的小
12、麦旗叶上表皮样品放大 200 倍后拍照 , 用 Axio Vi-sion 4.0 软件测量气孔长度和宽度 ( 包括副保卫细胞 ), 每块叶片测量连续的 5 个气孔 , 共测定 6 块叶片。实验结果1 植物叶片表皮样品制备方法的比较由改良法得到的表皮图片比较清晰 , 气孔及表皮细胞的边界清晰 , 无残余叶肉的干扰 , 易于辨认图 1 不同方法制备的小麦叶片表皮比较Fig.1 Comparison of wheat leaf epidermis made by different methodsa: 由改良法得到的表皮 ; b: 由胶带刮制法得到的表皮 ; c: 胶带自身的纹理 ; d: 由印迹法
13、 ( 火棉胶 ) 得到的表皮 ; e: 由印迹法 ( 指甲油 )得到的表皮 ; f: 改良法得到的表皮上气孔开闭情况。 均放大 200 倍。植物生理学通讯 第 46 卷 第 4 期 , 2010 年 4 月 397和测量 ( 图 1-a) 。 由于小麦表皮与叶肉结合较紧密 ,叶肉不容易彻底刮除 , 且胶带自身的透明性不佳 ( 图1-b), 由胶带刮制法得到的表皮模糊不利于辨认和测量 ( 图 1-c) 。 而由印迹法 ( 特别是火棉胶法 ) 得到的表皮边界模糊、 纹理复杂不易分辨和测量 , 而且在撕取胶膜时引起的印迹变形无法估算 ( 图 1-d 、e) 。 由图 1-f 可见 , 改良法制取的表
14、皮可以观察到张开的气孔。2 改良法可靠性的验证由改良法和徒手法得到的气孔长度分别为1.45 和 1.44 m, 相差 0.69%, 差异不显著 ( 表 1); 由改良法和徒手法得到的气孔宽度分别为 0.705 和0.708 m, 相差 0.43%, 差异也不显著。3 植物表皮样品制备改良方法的优化用 25% 的 NaClO 处理 1 、 2 min 后刮制的小麦叶片表皮样品 , 在表皮上还残留有叶肉细胞 ( 图 2-表 1 改良法和徒手法的小麦叶片表皮气孔的形态比较Table 1 Morphology comparison of wheat leaf epidermisstoma of imp
15、roved and hands free methods气孔长度 / m 气孔宽度 / m改良法 1.45 0.030 a 0.705 0.020 a徒手法 1.44 0.046 a 0.708 0.032 a表内数据为平均数 标准误差 , 小写字母相同表示在 0.5 水平差异不显著。a 、 b); 25% NaClO 处理 3 min 刮制的表皮样品无叶肉细胞残留 ( 图 2-c) 。 用 50% NaClO 处理 1 min的表皮依然有叶肉细胞残留 , 而处理 2 、 3 min 后叶片表皮较清晰 ( 图 2-d 、 e 、 f) 。 75% NaClO 处理 1 min 后刮制的表皮样品
16、较清晰 ( 图 2-g), 与 50%NaClO 处理 2 、 3 min 的效果相似。 75% NaClO 处理时间增加到 2 、 3 min 时 , 副保卫细胞边界模糊图 2 改良法的优化试验结果Fig.2 The optimization results of improved methoda: 25% NaClO 处理 1 min; b: 25% NaClO 处理 2 min; c: 25% NaClO 处理 3 min; d: 50% NaClO 处理 1 min; e: 50% NaClO 处理 2min; f: 50% NaClO 处理 3 min; g: 75% NaClO 处理 1 min; h: 75% NaClO 处理 2 min; i: 75% NaClO 处理 3 min 。 均放大 200 倍。植物生理学通讯 第 46 卷 第 4 期 ,
