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1、<p><p>&lt;p&gt;&amp;lt;p&amp;gt;一、抗糖尿病药物研究思路与方法 糖尿病是一种由遗传基因决定的全身慢性内分泌代谢性疾病。由于体内胰岛素的相对或绝对不足而引起糖、脂肪和蛋白质代谢的紊乱。胰岛素抵抗：正常剂量的胰岛素产生低于正常生物效应的一种状态。糖尿病分型：1型糖尿病（细胞破坏，导致胰岛素绝对缺乏）A.免疫介导性的（急进型和缓发型） B.特发性的2型糖尿病（胰岛素抵抗为主伴相对胰岛素不足或胰岛素明显缺乏伴胰岛素抵抗）特殊型糖尿病妊娠糖尿病一、寻找抗糖尿病新药的途径
2、(一)降血糖1、类似1型糖尿病的动物模型（1）四氧嘧啶高血糖动物模型原理：Alloxan是一种胰岛细胞毒剂，通过超氧自由基选择性地破坏细胞，使细胞内的DNA损伤，mRNA功能受损，合成前胰岛素减少，导致胰岛素绝对缺乏，引起实验性糖尿病。给药途径：静脉注射（iv）&amp;amp;amp;腹腔注射（ip）剂量：动物敏感性不同，剂量不同特点：水溶液不稳定；对光敏感；血浆半衰期12 min；不能引起豚鼠糖尿病；大鼠形成模型后可自行缓解（部分）；猫犬形成永久性糖尿病。（2）链脲霉素高血糖动物模型原理：STZ结构中的亚硝基脲是细胞毒，去氧葡萄糖部分使之易进入细胞。STZ通过自由基损伤细胞
3、，造成胰岛素缺乏。一次大剂量注射可致细胞坏死而无胰岛炎，小剂量连续注射，可产生胰岛炎及相关的糖尿病，后者涉及T细胞参与的自家免疫机制。特点：水溶液极不稳定；0.1M柠檬酸缓冲液（pH 4.0-4.5)配制；腹腔注射 静脉注射；大鼠 5580 mg/kg；能引起豚鼠糖尿病。,2、自发性遗传性1型糖尿病模型原理：有自家免疫等病因参与，胰岛细胞受损，因而胰岛素缺乏，动物不肥胖。常用于1型糖尿病病因、病理生理的研究。动物：中国地鼠、BB大鼠、NOD小鼠、3、类似2型糖尿病的动物模型实验性肥胖及糖尿病动物模型：遗传基因高糖或高脂饲料（如C57） 实验性肥胖及糖尿病大鼠模型：小剂量STZ高热量饲料4、自发
4、性2型糖尿病动物模型动物：进口或引进，饲养条件要求高，价格昂贵。大约有20余种：db/db小鼠、KK小鼠、ob/ob小鼠、OLETF 大鼠、Zuker（fa/fa）大鼠、Wistar fatty大鼠等。5、正常动物（大鼠、小鼠）根据研究的目的或切入点不同，也可以选用正常动物作为模型。如在研究促胰岛素分泌药物作用时，选正常动物较合适又经济。观察指标 ：血糖（葡萄糖氧化酶法）；糖耐量 （葡萄糖耐量、蔗糖耐量、淀粉耐量）；糖化血红蛋白(HbA1c)（HPLC、琼脂凝胶电泳法、等电点聚焦法、亲和色普微柱法）；果糖胺；胰岛素6、离体模型：细胞模型、酶活性（a-葡萄糖苷酶活性抑制）（二）改善胰岛素抵抗动物
5、模型：抗胰岛素激素诱发的动物模型、MSG肥胖动物模型观察指标：胰岛素耐量、胰岛素敏感指数、正常血糖高胰岛素钳夹技术（三）调节脂质代谢异常动物模型 ：高胆固醇乳剂诱发的大鼠、小鼠模型；Triton WR 1339 (iv)；乙硫胺酸诱发（P.O.）；高胆固醇饲料诱发家兔高血脂模型；STZ金黄地鼠高血脂模型观察指标：血甘油三酯（TG） 、胆固醇（Chol）、游离脂肪酸（FFA）、HDL肝TG、Chol （四）防治慢性并发症动物模型：糖性白内障大鼠模型、观察指标：抗氧化（脂质过氧化物质；抗氧化酶：SOD、过氧化氢酶）；AGEs；神经传导速度；晶体混浊度二、抗糖尿病药物作用机制的探讨胰岛素分泌，胰岛素
6、受体，受体后效应其它：减少过量的肝糖生成增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌作用于胰岛素信号转导通路的特异分子二、薄层色谱、高效液相色谱法在药理学中的应用往年考题：高效液相色谱法及薄层色谱法在生物样品分析中，各有哪些优缺点。（？看课件）薄层色谱法与高效液相色谱法比较 薄层色谱 高效液相色谱色谱系统 开放式 闭路展开方式 展开 洗脱流速控制 吸附剂的毛细管作用 由泵调节平衡时间 短 不定分析样品 同时分析多个样品 每次一个样样品量 高 低板高（um） 30 2-5 有效板数 &amp;amp;lt;600 5000检测方式 静态，可用的手段较多 动态，多采用紫外检测器溶剂用量 少 多溶剂更
7、换 易 难固定相 一次弃去 反复使用前处理 简单 较复杂三、免疫组织化学实验方法免疫组织化学：利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。酶标抗体法：通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面或内部某种抗原成分定位观察。常用的酶-辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。优点：与免疫荧光技术相比，终产物可在普通光镜下观察，切片能够长久保存，经锇
8、酸处理后，电子密度增强，可用于电镜观察。抗生物素-生物素-过氧化物酶技术(avidin-biotin peroxidase complex ABC)原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的。常用：? ABC-HRP 辣根过氧化物酶：最通用的系统，使用范围广? ABC-ALP 碱性磷酸酶：灵敏度比较高，染色密度较低 ? ABC-GOD 葡萄糖氧化酶：灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或者AP含量比较高的
9、组织，常与HRP或者AP系统配合进行双染ABC法的特点：? 敏感性强 ? 特异性强，背景染色淡? 方法简便，节约时间? 可用于双重或多重免疫染色。双重免疫荧光标记法-在同一组织切片上检测多个抗原免疫金染色原理：免疫金染色技术使用胶体金耦联抗体，然后在光学显微镜下检测抗原。解决了免疫组化里内源性酶干扰的问题。整个检测过程中无需酶的参与，因此不必预先处理样本以消除内源性酶的活性。四、药物代谢酶研究方法药物代谢酶的组成I 相酶：以细胞色素P450（Cytochrome P450, CYP 450s）为代表，主要催化底物的氧化、还原、水解反应，使其代谢激活或灭活。II相酶：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(
10、UDP-glucuronyltransferase, UDPGT)、谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S transferase, GST）等则主要参与结合反应，加速药物或化学毒物本身及代谢产物以结合物的形式排出体外。CYP450的特性光谱特性：含量测定，结合类型膜结合特性：分离纯化底物特异性：同工酶鉴定多态性：生物转化机制可诱导性：调控和药物相互作用CYP450调控诱导：与核受体或阻遏蛋白结合基因调控区，促进合成蛋白稳定作用抑制蛋白激酶对P450的磷酸化 Ah受体(aromatic hydrocarbon receptors)-P1孤儿受体 (orphan receptors-内源
11、性、生理配体不清)CAR：组成型雄烷受体，PB和亲脂类化合物等（2B）PXR：孕烷核受体，天然和合成的甾醇类等（3A ）PPAR：过氧化物酶体增殖因子活化受体，非基因毒性 致癌物等(4A)mRNA稳定作用(2E)抑制：竞争分子氧或底物1. 诱导内源物代谢 干扰机体内环境，导致疾病。如苯妥英或利福平引起的甲低、骨软化。外源物代谢 （1）肝毒性：PB加重APAP的肝坏死，乙醇诱导NDMA的致癌性。（2）药物：代谢增加而失效，药物相互作用，毒性和不良反应。如诱导剂增加环孢素的用量，华法令的半衰期缩短，利福平使避孕药失效。2. 抑制（酶蛋白水平）可逆性抑制：快速、可逆的结合，竞争活性中心，抑制程度取决
12、于抑制剂的浓度和亲和力，强度-Ki&amp;amp;lt;1mol。准不可逆抑制: 可逆但作用时间长，形成中间代谢复合体（M1复合体），中间代谢产物形成时间长，解离速度慢。不可逆抑制：活性丧失，不可逆的共价结合，抑制程度取决于抑制剂总量、酶的数量和抑制剂在酶与其他生物大分子之间的分配比。意义：制备理想的研究体系内外源物与CYP450的相互作用药物相互作用与临床用药药物代谢酶研究方法：1.CYP450测定：还原状态下可与CO 结合，在波长450nm出现吸收峰，用于含量测定。2. 肠道和肝脏的首过效应（代谢稳定性）3.代谢稳定性4. 参与代谢的药酶鉴定5.药酶诱导与抑制五、大动物心
13、肌缺血及心力衰竭模型建立方法一、目前常用的心肌梗塞指标有哪几种？答：目前常用的心肌梗塞指标有以下几种：1、心电图：肢体导联或胸前导联缺血性ST段抬高或降低，T波异常变化及病理性Q波出现。2、心外膜心电图：在开胸犬前壁放置7-36个电极引出心外膜心电，常以结扎冠状动脉左前降支后，心外膜电图ST段升高的电极数表示心肌梗塞范围的大小，以ST段升高的总量反应心肌损伤的严重程度。3、血流动力学指标：使用电磁流量计、压力换能器、多导生理记录仪等设备，可记录心室内压、心输出量、冠脉流量、肺动脉契压等指标，反映心肌缺血时血流方面的改变。4、组织学染色：用红四氮唑（TTC）可使正常细胞着色，而坏死细胞没有反应，
14、硝基四氮唑兰（NBT）作用则相反，以此可清楚的将缺血区域区分出来。5、生化代谢改变：心脏流出血液中乳酸和脂肪酸水平升高，说明无氧代谢和脂肪分解加强；心肌细胞坏死可释放出乳酸脱氢酶（LDH）和磷酸肌酸激酶（CK），其外周血水平同样升高。6、组织形态学改变：心肌切片可见明显坏死样病理变化。六、脑卒中治疗药物评价方法1、抗脑缺血药物的分类及代表药物？ （1）改善脑供血的药物 血管扩张药，如潘生丁等 改善微循环、扩充血容量的药物：如低分子右旋糖酐等 溶解血栓的药物：尿激酶等 抗凝药物：肝素等 钙离子拮抗剂：尼莫地平等 防止血小板凝聚的药：阿司匹林等（2）脑功能保护药物（神经保护剂） 钙通道阻滞剂（尼莫地平） 自由基清除剂（依达拉奉） 谷氨酸释放抑制剂及受体拮抗剂 腺苷转运抑制剂 白细胞黏附抑制剂及抗炎药物 NO合酶抑制剂 其他（抗凋亡药，GABA增强&amp;lt;/p&amp;gt;&lt;/p&gt;</p></p>
