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1、随堂练习5,. 何谓新陈代谢？ 2. 简述微生物的营养及营养类型。 3. 简述微生物的产能代谢。 4. 简述微生物的呼吸类型及其特征 5. 简述细菌的生长曲线及其各个时期的特征。 6. 简述影响微生物生长的环境因素。 7. 简述氧化还原电位的定义，它代表什么含义？,资源微生物技术,第4章 微生物技术基本试验,第4章 微生物技术基本试验,4.1 培养基的配制 4.2 灭菌方法 4.3 接种方法 4.4 细菌总数目的显微镜计数方法 4.5 细菌的生长曲线 4.6 菌体的红外光谱测定样品制备方法 4.7 菌体的扫描电镜样品制备方法 4.8 菌体表面Zeta电位的测试方法,4.1 培养基的配制,1、氧
2、化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans ,autotrophic bacteria)，一般都用西尔弗门(Silverman)培养基进行培养，这种培养基的配方为： 溶液I： 3.0g (NH4)2SO4 0.1g KCl 0.5g K2HPO4 0.5g MgSO47H2O 0.01g Ca(NO3)2 700ml 蒸馏水,西尔弗门(Silverman)培养基配制方法,溶液II： 44.2g FeSO47H2O 300ml 蒸馏水， 1ml 10N 硫酸溶液。 溶液I在0.1MPa下灭菌，溶液在0.05MPa下灭菌，在使用前把两种已灭过菌的溶液混合。因这种培养基中Fe2
3、+的含量为9g/L，所以又称为9K培养基。,9K培养基组成,T.f菌的9K培养基组成： 44.2g/L FeSO4.7H2O, 3.0g/L (NH4)2SO4, 0.1g/L KCl, 0.5g/L K2HPO4, 0.5g/L MgSO4.7H2O, 0.01g/L Ca(NO3)2,2号培养基的配制方法,2、草分枝杆菌Mycobacterium phlei与诺卡氏菌Nocards bacillus的培养基为2号培养基。(heterotrophic bacteria) 2号培养基组成为： 牛肉膏beef extract 3 g， 蛋白胨peptone 10 g， 氯化钠sodium chl
4、oride 5 g， 蒸馏水 1 L， （琼脂agar 1520 g ） pH=7.0-7.2。,固体培养基的配制,固体培养基 solid medium,灭菌后摆斜面,Dissolve nutrients, Add 1.5-3.0% coagulant(agar, gelatin, silica gel),3. Sterilize and place it obliquely.,液体培养基的配制,放入灭菌锅前的液体培养基,4.2 灭菌方法,高压蒸汽灭菌法： 1、用途 （1）无菌水的制备 （2）玻璃器皿的灭菌 （滴管、移液管、锥形瓶、烧杯） （3）培养基的灭菌 2、121.5 MPa 下灭菌 2
5、030分钟。,试管或锥形瓶口的密封方法,不正确的棉塞,试管帽,正确的棉塞,棉塞的叠法,棉塞的叠法,蒸汽高压灭菌锅,电加热圈,水位线,压力表,安全阀,放气阀,灭菌器,高压蒸汽灭菌步骤,开始加热时， 打开放气阀； 加热至放气阀冒出蒸汽； 5分钟后，关上放气阀； 开始计时，灭菌30分钟； 关上电源开关，自然冷却； 至压力表指针为零，打开放气阀； 打开锅盖6个密封旋钮。,步骤： 1、接种前将无菌操作台、接种环、培养基紫外线灭菌30分钟 （摆好了斜面的试管装固体培养基、表面皿装的固体培养基、锥形瓶装的液体培养基）,4.3 接种方法,接种环,无菌操作台,2、点燃酒精灯； 3、将接种环的钨丝在酒精灯火焰上加
6、热变红（灭菌）， 4、用接种环在菌种保存试管中轻轻刮少许细菌， 5、快速将带有细菌的接种环浸入液体培养基中； 或在固体培养基中画“之”字形或“井”字形。见下图,4.4 细菌总数目的显微镜计数方法,特制的载玻片正面图,特制的载玻片侧面图,步骤： 1、 将细菌 悬液用蒸馏 水稀释 A倍； 2、 将配好 的细菌稀释 液滴入在玻 片上； 3、 盖好盖 玻片。,n=(n1+n2+n3+n4)/4,N2,N3,N4,N5,载玻片上刻有的大方 格的尺寸： 边长1.0 mm, 盖上盖 玻片，则其间高度为 0.1 mm。 因此，每个大方格的 体积为0.1 立方毫米。,n1,n2,n3,n4,4.4 细菌总数目的
7、显微镜计数方法,计算步骤 1、 n （n1 + n2 + n3 + n4 ）4 2、 N1 16n 3、 N （N1 N2 N3 N4 N5）5 4、 一个大方格（0.1立方毫米）中细菌的总数 N25 5、 1 mL 1 立方厘米 1000 立方毫米； 细菌液稀释了A倍。 6、 1 mL 溶液中总的细菌数为(个) 100025NA0.1,4.5 细菌的生长曲线,在HZQ-C空气浴震荡器中，在28C、160 r/min的震荡频率下培养细菌； 每隔24 h取出100 mL菌悬浮液，采用转速为16000 r/min TGL16台式高速离心机离心分离10 min后测细菌的湿重。 然后绘制细菌生长时间(
8、h)与细菌生长量(每100 mL菌液中菌体湿重量)曲线。,空气浴震荡器,草分枝杆菌的生长曲线,4.6 菌体的红外光谱测定样品制备方法,操作步骤： 1、离心分离菌体； 2、用蒸馏水洗涤； 3、在50 C的恒温烘箱中干燥； 4、取干燥的菌体与光谱纯溴化钾一起在玛瑙研体中研磨； 5、将适量的粉末放入压片机中，进行压片； 6、用红外光谱仪(510P FTIR型)对样品进行分析测定。,红外光谱的基本概念,* 红外光谱是一种吸收光谱。在4000400 cm1的红外线照射下，有机物分子选择性地吸收其中某些频率后，用红外光谱仪记录所形成的吸收谱带，就称为红外光谱。 * 红外光谱的横坐标是波数（cm1）或频率；
9、纵坐标是光线的透过率（T），或摩尔吸收系数来表示： 1/（CL） * lg（I0/I） C浓度 L比色池厚度 I透过光的强度 I0入射光的强度,为什么不同有机基团会产生不同的红外光谱？, -OH、-SH、-NH等化学键存在振动。 振动形式有：伸缩振动、弯曲振动。 弯曲振动包括： 面内弯曲（剪式振动 、平面摇摆振动） 面外弯曲（ 非平面摇摆振动、扭曲振动） 伸缩振动包括： 对称伸缩振动、不对称伸缩振动, 化学键振动存在振动频率、存在振动能级。没 有外界干扰时，分子处于最低的振动能级。 当红外光线照射到有机基团的化学键上时，分 子发生振动能级跃迁，跃迁需要吸收一定的能 量，该能量通常由照射的红外光
10、来供给。 化学键的键能、键长、键角、种类如单键、双 键、叁键、共价键、离子键等是决定吸收多少 能量的内在因素，也就是决定红外光谱的峰位、 形状、峰强的内在因素。反过来说，红外光谱 可以提供分子内部键参数的信息。,红外光谱基本原理,红外光谱基本原理, 红外光谱所提供的能量与有机基团结构的振 动能级差相吻合； 紫外光线、可见光线提供的能量则不与有机 基团结构的振动能级相匹配； 红外光线提供的能量不与无机物的分子结构 振动能级相匹配！,红外光谱识谱法,1、三个重要特征 * 谱带位置：基团的最有用的特征，给出基团的信息 * 谱带形状：给出基团信息 * 谱带的相对强度：给出两个信息， 一是定量的概念；二
11、是指示某特殊基团或元素存在,4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500,苦味诺卡氏菌的红外光谱,Wavenumber cm-1,Transmittance %,Transmittance %,4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500,Wavenumbers cm-1,吸附了Pb2的诺卡氏菌 红外光谱图,吸附了Zn2的诺卡氏菌 红外光谱图,诺卡氏菌的红外光谱,吸附了Pb2、Zn2后的苦味诺卡氏菌体红外光谱分析（一）,吸附了Pb2、Zn2后的苦味诺卡氏菌体红外光谱分析（二）,* 吸收谱带区：分子中各键的振动频率常常受到整个分子的
12、影响，但是有些键如羰基、OH、NH等因吸收峰位于高频区，故受分子中其他结构的影响较小，高频区40001333 cm1的吸收峰比较稀疏，易于辨认，通常也叫特征谱带区、该区能用来鉴定官能团存在的吸收峰称作特征吸收峰。 * 指纹区：低频区1333667 cm-1，这一区域谱带特别密集，犹如人的指纹，各种化合物在结构上微小差别在指纹区都会得到反映，因此，对鉴别有机化合物很有用处。 * 相关峰：一个基团常有数种振动形式，每种红外活性的振动通常都相应地产生一个吸收峰，习惯上把这些相互依存而又相互佐证的吸收峰叫做相关峰,红外光谱识谱法 (三个区),4.7 菌体的扫描电镜样品制备方法, 微生物样品在用于扫描电
13、镜观察之前，需经过清洗、 固定、脱水等步骤。 固定是指用化学固定剂迅速杀死细胞的过程。固定 的目的是尽可能使细胞中的各种物质保持生活状态 的结构，并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。 经过良好固定的细胞物质，不会由于后序的脱水处 理而发生移位或丢失。,扫描电镜样品制备方法,扫描电镜生物样品的制备步骤如下： (1) 1戊二醛溶液的配制：取50 mL 0.2 mol/L磷酸缓 冲溶液于100 mL容量瓶中，加入4 mL 25戊二醛 （市售的常见浓度）水溶液，加蒸馏水至满刻度。 (2) 把离心分离后的细菌放入10 mL配制的1戊二醛溶 液中固定2030 min，固定时采用搅拌，使材料均 匀地分布在
14、固定液中。,(3) 离心分离（16000 r/min），使固定液与 细菌分开，弃去上清液。 (4) 用磷酸盐缓冲溶液（0.1mol/L， pH 7.2）漂洗并 重新离心，弃去上清液，反复离心几次。 (5) 用逐级上升浓度的乙醇，从30%5070 % 80 %90 %无水乙醇（34次），脱水，每级 10 min，过急的脱水会引起细胞的收缩变形。,扫描电镜样品制备方法,(6) 用滴管将含有细菌的乙醇液滴在洁净抛光 的铝片（10 mm10 mm2 mm）上， 干燥、喷金。 (7) 在SSX-550型扫描电镜上观察细菌细胞的 显微图像。,扫描电镜样品制备方法,微生物的扫描电镜图片,吸附前的诺卡氏菌 吸
15、附后的诺卡氏菌,步骤: 1、将细菌离心分离；用电解质溶液配成细菌悬浮液。 2、用针头将细菌悬浮液抽到电泳槽小室中。 3、在电泳仪上测出细菌微粒的电泳淌度 电泳淌度单位时间、单位电压降下的微粒移动的距离（cm2/s.V）,4.8 菌体表面Zeta电位的测试方法,小室,用WD-9408D型微电泳仪，在离子强度为0.001mol/L的NaCl溶液中，测定菌体微粒的电泳淌度。根据公式计算出电位。 = (ku0/D)91012 （mV） 其中， k 为颗粒形状系数。 当颗粒为球形时k取6；当颗粒为杆形时k取4； 为溶液的粘度（Pas） D 为溶液的介电常数（无量纲） u0 为微粒的电泳淌度（m2/sV）。,不同pH值下细菌微粒的表面电位, potential of microorganism part
