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1、1,动物细胞培养 生物反应器,1,细胞培养工程 南开大学,2,4. 分子传递现象,2,细胞培养工程 南开大学,3,分子传递的基本物理现象,扩散（Diffusion） 由于分子碰撞而传递热能所引起的分子随机运动 举例：气泡外周液体滞流层内溶解氧分子的扩散,3,细胞培养工程 南开大学,对流（Convection） 由于流体主体的运动所引起的传递 举例：滞流层被从气泡外周置换离开气泡之后，溶解氧分子随液体流动而位移至反应器的其它位置,4,扩散,在流体（气体或液体）内部，分子间每秒钟发生数以万亿次碰撞，每次碰撞都会导致溶质和溶剂分子的运动方向改变； 分子的扩散速度取决于其大小、形状、温度和流体粘度（流
2、动阻力）； 宏观效果：分子从浓度较高区域迁移至较低区域； 可类比物理现象 热量（温度） 流体流动（压力）,4,细胞培养工程 南开大学,5,扩散,菲克第一定律（Ficks first law） 在单位时间内，通过垂直于扩散方向的单位截面积的扩散物质流量与该截面处的浓度梯度成正比，即浓度梯度越大，扩散通量越大 扩散物质流量：单位时间内，分子 L 通过单位面积 的净数量,5,细胞培养工程 南开大学,分子 L 的 有效扩散系数,分子 L 沿扩散方向的 浓度梯度,6,扩散：室温下物质的扩散系数范围,物质与扩散媒介 扩散系数 (cm2s-1),6,数据来源：Transport Phenomena in B
3、iological Systems (2nd ed., 2009),细胞培养工程 南开大学,7,扩散,分子尺度与分子两次碰撞间迁移尺度比较 气体：分子大小 远远小于 两次碰撞间迁移尺度 液体：分子大小 远远大于 于两次碰撞间迁移尺度,7,细胞培养工程 南开大学,8,扩散,Einsteins Equation x = (2Dt)1/2 x 迁移距离 D 有效扩散系数 t 扩散时间,8,细胞培养工程 南开大学,应用 估算细胞内分子相结合（相遇）所需时间 采用偏微分方程积分方法，计算静态液相蛋白质分子或病毒颗粒与固定的配基、受体或细胞相结合的累积量，以优化检测方法,9,对流（流动）,由于重力、压力或
4、剪切力的存在，流体（气体或液体）主体发生流动，溶于其中的溶质随之移动； 溶质的扩散现象同时存在 如果流体流动相对比较慢，溶质的扩散现象对其传递起主导作用； 如果流体流动相对比较快，液体主体流动对溶质的传递起主导作用； 粘度：流体对流动的摩擦阻力，受温度和压力影响 密度：显示物质内部分子之间的紧密程度,9,细胞培养工程 南开大学,10,对流：流体概念,定义：在剪切力的作用下发生连续形变的物质 分类 物理状态 气体 液体 可压缩性（密度） 粘度 牛顿 非牛顿流体,10,Doran：Bioprocessing Engineering Principles,细胞培养工程 南开大学,11,对流：流线概念
5、,定义 沿着流路，并显示流速与相对位置关系的表示方法； 线条的疏密程度表示流速的相对大小。,恒定流速 低流速中有障碍物 发酵罐挡板区域,层流,湍流,漩涡,（Doran：Bioprocessing Engineering Principles）,细胞培养工程 南开大学,12,对流：雷诺准数（Re）,流体的流动状态，取决于流体的流速、粘度、密度、以及流路的几何形状； 雷诺准数是用来描述流体的流动特点的参数（无物理单位）,12,圆形横截面管道 搅拌式发酵罐搅拌桨,D 管径 平均线性流速 流体密度 流体粘度 层流：小于 2,100 过渡：2,100 - 4,000 湍流：4,000,Ni 搅拌桨转速
6、Di 搅拌桨管径 流体密度 流体粘度 搅拌桨形状对液体流动状态影响 很大，层流状态一般低于 10,细胞培养工程 南开大学,13,对流：边界层概念,定义 当流体与静止物体相接触时，受到影响的流体薄层被称作边界层； 在静止物体表面，流速为零，称作静止层； 由于流体粘度作用，边界层内部与静止层相邻的液层流速会降低（粘滞阻力）；离静止层越远，粘滞阻力越弱，流速越高，逐渐接近主体流速。因此，在边界层内部存在一个速度梯度。,13,意义：边界层的存在，不仅影响流体流动的性质，而且会影响各相之间传热和传质。,（Doran：Bioprocessing Engineering Principles）,细胞培养工程
7、 南开大学,14,对流：粘度概念,流体薄层,内部同心圆柱体的转动能否带动外圆筒的转动？ 液体的性质：拉拽作用力的传导介质 液体介质的作用面积直接影响作用力大小 Brookfield 粘度计工作原理,14,细胞培养工程 南开大学,15,对流：粘度（）,将液体注入上下两块平板之间，距离 D，面积为 A 当下板发生移动时，流体随其运动，但上板表面液体速度为零，因此形成速度梯度 剪切力 F 与速度梯度成正比,15,4. 剪切应力定义,Doran：Bioprocessing Engineering Principles,细胞培养工程 南开大学,粘度,16,流体的流变学分类,细胞培养工程 南开大学,17,
8、对流：粘度的意义,17,粘度（常温） 密度 运动粘度,粘度是影响流体行为最重要的流体性质，相当于流体本身对流动所施加的摩擦阻力，损耗机械能 粘度对流体的泵送、搅拌混合、传质、传热和液体通气，都有显著作用，因此，对于生物过程设计以及经济成本也有重要影响 培养液的粘度受细胞、底物和空气影响。,细胞培养工程 南开大学,18,5.搅拌式生物反应器 液体流动与混合,18,细胞培养工程 南开大学,19,搅拌式生物反应器内部基本结构,19,搅拌桨,搅拌轴,罐体,细胞培养工程 南开大学,20,搅拌式生物反应器 - 搅拌桨主要类型,Marine Pitched-blade Turbine Rushton Tur
9、bine,轴向兼径向混合 径向混合,Elephant Ear,20,细胞培养工程 南开大学,21,搅拌式生物反应器 径向混合流型,Rushton Turbine,21,细胞培养工程 南开大学,微混合为主，兼有主体混合效果，氧传质效果较强 高剪切力，适合微生物发酵 高 H/D 反应器可配置多个搅拌桨,22,搅拌式生物反应器 轴向混合流型,22,细胞培养工程 南开大学,轴向主体混合为主，搅拌温和 大桨叶设计更适合大规模细胞培养,23,搅拌式生物反应器 搅拌混合机理,交换：湍流状态下，固态物质间发生相对运动 剪切力：层流状态下，液层之间相对运动 扩散：分子水平的交换。,搅拌桨作用,较大 漩涡,较小
10、漩涡,最小 漩涡,扩散作用,Kolmogorov scale（cm）,培养基运动粘性系数 (cm2/s) 单位质量流体能量耗散速率 (cm2/s3),细胞培养工程 南开大学,24,搅拌式生物反应器 混合效果评估,方法：在固定位点跟踪标示物浓度,24,细胞培养工程 南开大学,25,搅拌式生物反应器 混合效果评估,Ci ： 标示物初始浓度 Cf ： 标示物最终浓度 Tc ： 循环时间 Tm： 混合时间，指达到所设定均匀度所需时间， 一般定义为 0.1 (Cf - Ci) 混合时间越短意味着混合效果越好,25,细胞培养工程 南开大学,26,6. 搅拌式生物反应器 气 - 液传质,26,细胞培养工程
11、南开大学,27,引言,细胞生长需要齐备的营养供给，,限制性底物浓度对 比生长速率（）的影响,27,细胞培养工程 南开大学,当其中一种底物浓度（Si）降低至制约细胞生长，成为限制性底物，,Monod 方程,当,28,溶解氧作为底物,氧是细胞生长和代谢所必需底物之一 氧在水溶液中的溶解度极低,28,细胞培养工程 南开大学,为了满足细胞的生理要求，反应器操作（主要是搅拌转速和通气流量）必须及时向培养体系提供氧气，避免耗尽,29,氧的溶解度,一个大气压下，温度对纯氧在水中溶解度的影响,一个大气压下（25oC）, 纯氧在不同浓度电解质溶液中的溶解度,来源： Bailey & Ollis (1986),
12、Biochemical Engineering Fundamentals (2nd ed.), p 463,29,细胞培养工程 南开大学,30,搅拌式生物反应器 通氧方式,（2）顶部通氧（辅助） 通氧效率较低，适合细胞浓度低的接种初期阶段 不产生气泡,（1）底部通氧（主要） 通氧效率高 产生气泡，需要采取保护措施,细胞培养工程 南开大学,31,WAVE Bioreactor - Cellbags,细胞袋预先消毒，一次性使用，不必清洗 通过支架的摇摆实现主体混合 DO/CO2/pH 控制 0.1 - 500L,细胞培养工程 南开大学,32,特殊细胞营养物质 - 溶解氧（DO）,细胞生理代谢需要量
13、最大的必需营养物质： 1 C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O 氧气以溶解氧（DO）形式在水溶液中存在，常温下溶解度非常低 一个大气压 空气（其中 O2 占 21%） 37oC 培养基溶液（盐类溶质的存在降低其溶解度） 饱和浓度约为 0.21 mM 相较于葡萄糖浓度（如 25 mM），溶解氧不足以满足细胞生长需要，需要不断提供通氧（向反应器内部鼓气，或培养基顶部界面换气） (25 - 0) x 6 / (0.21 - 0) = 714.3 (倍) 细胞膜对氧分子具有通透性，氧分子通过被动扩散进入细胞内部,32,细胞培养工程 南开大学,33,在不通氧的条件下，DO 耗竭需要多久？,
14、假设条件： 活细胞密度为 5 x 106 (cells/mL) 细胞比需氧量为 3.2 x 10-13 (moles/cell/hour) 培养基为 100% 空气饱和（一般为 50% 左右），纯氧饱和溶解度为 1.0 mM。 计算（以1000 毫升计算）： 1000 毫升培养液中 DO 的总量为 (1.0 mM x 21% - 0) = 0.21 (mmoles) = 0.21 x 10-3 2. 1000 毫升培养液中总活细胞数量为 5 x 106 (cells/mL) x 1000 (mL) = 5 x 109 (cells) 3. 活细胞每小时的需氧量（假设不随 DO 降低而变化） 5
15、 x 109 (cells) x 3.2 x 10-13 (moles/cell/hour) = 1.6 x 10-3 (moles/hour) 耗尽 DO 所需时间为 0.21 x 10-3 (mles) /1.6 x 10-3 (moles/hour) = 0.13 (hour),33,细胞培养工程 南开大学,34,反应器通氧与搅拌,Case a： 通气量过高，搅拌速率过低，气泡围绕搅拌轴区域上升，搅拌桨起不到打散和分散气泡的作用（最低搅拌速率）； Case e： 搅拌速率过高，上升气泡会再次回到主体，桨叶与气泡过多接触减少桨叶对液体的拉拽，降低液体主体的能量输入和混合（最高搅拌速率）。,
16、34,细胞培养工程 南开大学,35,搅拌式生物反应器 搅拌器转向,“Pump Down” - 延长气泡停留时间,35,细胞培养工程 南开大学,36,氧分子从气泡到细胞内传递步骤,从气相主体扩散到气 - 液界面 迁移并穿过气-液界面 扩散并穿过第一个滞流层（最主要传质阻力），进入流体主体 在主体流体中传递，进入第二个滞流层 扩散并穿过第二个滞流层 进入细胞内部参与生化反应（7）,37,气 - 液传递,37,传递机制：成分 A 从气相进入液相，浓度梯度从气相到液相，由高到低,气相 CAG A 在气相主体的浓度 CAGi A 在气 - 液界面的浓度 kG A 的气相传递系数,液相 CAL A 在液相主体的浓度 CALi A 在气 - 液界面的浓度 kL A 的液相传递系数,38,气 - 液传
