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1、河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试 虢舢雠：移绢舞知 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人已发表或撰写的研究 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名：和怨 新碑咿 夕年月1 7 日 t j 目录 中文
2、摘要1 英文摘要6 英文缩写1 3 研究论文乳腺癌干细胞分离鉴定及免疫治疗研究 引言15 第一部分乳腺癌M C F 7 细胞系中C D 5 5 b i g 亚群生物学特性分析 前言2 0 一刖舌 材料与方法2 3 结果m 2 6 附图2 7 附表31 讨论3 2 I 、结3 4 参考文献3 5 第二部分化学药物及免疫治疗对乳腺癌M C F 7 细胞系中C D 5 5 b i g 亚群 的杀伤研究 前言3 7刚吾r 3 7 材料与方法3 8 结果4 3 附l 訇4 5 附表4 7 讨论4 9 小结5 2 参考文献5 3 第三部分原发性乳腺癌组织d P C D 5 5 h l g 细胞检测及其临床
3、意义 前言5 6刖吾，O 材料与方法5 7 结果5 8 附图5 9 附表61 讨论6 3 爿、结一6 6 参考文献6 7 综述一乳腺癌干细胞研究进展6 9 综述二乳腺癌免疫治疗的研究进展9 0 ! i ! 殳谢1 0 1 个人简历”1 0 2 中文摘要 乳腺癌千细胞分离鉴定及免疫治疗研究 摘要 目的：肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中具有自我更新和分化潜能的细 胞，是肿瘤形成的起始细胞，维持肿瘤生长，是肿瘤复发转移的根源。通 过对肿瘤干细胞的分选鉴定可以使我们能更清晰认识其特征，从而寻找新 的方法来治疗肿瘤，提高治愈率。肿瘤干细胞理论认为肿瘤是由肿瘤干细 胞异常增殖、分化而形成的，常规治疗仅能消灭增
4、殖期的非致瘤性肿瘤细 胞，从而使肿瘤缩小甚至消失，但是当治疗停止后，具有耐药性的肿瘤干 细胞再次增殖形成肿瘤，并像“蒲公英”一样到处播散。如果我们能去除 乳腺癌干细胞，肿瘤将会永远消退，从而达到根治肿瘤的目的。近年来， 免疫治疗正逐渐成为肿瘤综合治疗的研究热点，有望成为肿瘤治疗的又一 主要手段。免疫治疗中常用的活性细胞有：淋巴因子激活的杀伤细胞 ( L A K ) 、肿瘤浸润淋巴细胞( T I L ) 、细胞因子诱导的杀伤细胞( C I K ) 乖N 特异 性细胞毒T 淋巴细胞( C T L ) 。有报道提出，利用树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l ， D C )
5、的高抗原递呈活性，将乳腺癌细胞抗原肽负载D C ，从而激活机体免 疫反应，可促进抗瘤效应和特异性。树突状细胞作为唯一的专职抗原递呈 细胞( a n t i g e np r o c e s s i n gc e l l ，A P C ) ，处于免疫反应的中心地位。非成熟的 D C 捕获抗原后被激活成为成熟的D C ，其细胞表面表达M H CI 类和I I 类 分子、共刺激分子B 7 1 ( C D 8 0 ) 和B 7 2 ( C D 8 6 ) 、黏附分子C D 5 4 ( I C A M 。1 ) 和C D 5 0 ( I C A M 3 ) 等，并将抗原肽递呈给C D 4 + 和C D
6、8 + T 细胞，诱导其成 为特异性细胞毒性T 细胞( C T L ) ，分泌细胞因子( 如I L 1 2 等) ，产生T h l 型免疫应答而发挥抗肿瘤作用。 本研究拟采用流式细胞仪测定乳腺癌M C F 7 细胞系中C D 5 5 高表达 ( C D 5 5 h j g ) 细胞平均荧光密度值，并分选C D 5 5 h g 细胞，分析其是否具有 肿瘤干细胞特性，并以此来检测原发性乳腺癌组织中乳腺癌干细胞的比 例，从而寻找一种从乳腺癌组织中分离肿瘤干细胞的方法；术中摘取乳腺 癌患者腋窝淋巴结，从腋窝区域引流淋巴结单个核细胞中，诱导培养D C s 和肿瘤抗原特异性C T L s ，通过体外杀伤实
7、验，为乳腺癌干细胞的治疗提 供新的方法和理论依据。 中文摘要 方法： 第一部分乳腺癌M C F - 7 细胞系中C D 5 5 u 。亚群生物学特性分析 培养乳腺癌M C F 7 细胞系，加入核酸染料H o e c h s t 3 3 3 4 2 和V e r a p a m i ， 流式细胞仪检测S P 亚群和M P 亚群细胞比例，并分离s P 亚群和M P 亚 群细胞，以C D 5 5 单克隆抗体标记S P 干细胞和M P 亚群细胞，测定S P 干细胞和M P 亚群细胞的C D 5 5 平均荧光密度值，再以C D 5 5 单克隆抗体 标记未分选M C F 7 细胞，测定C D 5 5 M
8、g 细胞所占比例，并分选收集C D 5 5 K g 细胞，检测其细胞贴壁率、克隆形成率和细胞周期等生物学特性，测定 C D 5 5 h i g 细胞是否具备肿瘤干细胞特性。 第二部分化学药物及免疫治疗对乳腺癌M C F - 7 细胞系中C D 5 5 h i g 亚群 的杀伤研究 用不同血药浓度( 1 0 、2 5 、5 0 、7 5 和1 0 0 ) 的化疗药物多 西他赛、表阿霉素和氟尿嘧啶杀伤乳腺癌M C F 7 细胞，以杀伤效果最高 的血药浓度的药物来杀伤C D 5 5 b i g 细胞和C D 5 5 l d w 细胞，酸性磷酸酶法测 定活细胞数检测其杀伤效应；抽取人外周血，淋巴细胞分
9、离液分离收集单 个核细胞，以m ( 1 5 0 0U m 1 ) 、抗C D 3 单抗( 1 0 0 删) 、I L 1 a ( 1 0 0 U 砒) 和几2 ( 1 0 0 0U m 1 ) 诱导培养，流式细胞检测C I K 细胞的表型分 子C D 3 、C D 4 、C D 8 和C D 5 6 表达，培养1 4 天后收集C I K 细胞，以效应 细胞比靶细胞4 0 ：1 杀伤C D 5 5 h i g 细胞和C D 5 5 l a w 细胞，酶标检测仪检测 杀伤率；术中严格无菌摘取乳腺癌引流淋巴结1 2 枚，用机械法获取淋 巴细胞悬液，并用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，以R P M l
10、l 6 4 0 完全培 养基重悬、培养2 h ，贴壁细胞以r h G M - C S F ( 1 0 0 0 U m 1 ) ，r h l L 4 ( 2 0 0 U m 1 ) 和T N F a ( 2 0 0 U m 1 ) 联合培养诱导D C s ；非贴壁细胞，加入r h l L 2 ( 2 0 0 U m 1 ) 培养为T D L N C s 。分选收集M C F 7 细胞中C D 5 5 K g 细胞，通过冻融法制备 肿瘤抗原，负载D C s ，将后者与T D L N C s 共培养，以诱导肿瘤特异性C T L s 。 分别培养至第1 天和第7 天收获D C s ，流式细胞分析仪检测
11、其C D l a 、C D 8 3 和C D 8 6 细胞表型，用非放射性细胞毒分析试剂盒，检测C T L s 细胞对 C D 5 5 h i g 细胞和C D 5 5 l o w 细胞体外杀伤活性，分析经诱导的D C s 功能和 C T L s 杀伤特异性。 第三部分原发性乳腺癌组织中C D 5 5 h i z 细胞检测及其临床意义 选取2 0 0 8 年2 月至2 0 0 9 年1 月在我科收治的乳腺癌患者4 5 例。术 中文摘要 中切取部分乳腺癌组织，机械法获得细胞悬液，加入抗C D 5 5 抗体和抗 C K l 9 抗体，对原发性乳腺癌单细胞悬液进行免疫荧光标记，以流式细胞 学方法进行
12、检测C D 5 5 高表达( C D 5 5 M g ) 群细胞的比例。结合患者的临 床资料，分析乳腺癌患者C D 5 5 高表达与临床病理学指标的关系。 结果： 1M C F 7 细胞染色H o e c h s t 3 3 4 2 染料后，流式细胞分析s P 比例为 4 3 4 - 4 - 0 5 9 ，而加入维拉帕米后显著减低为0 1 士0 0 7 。 2 收集S P 和M P 细胞，分别标记C D 5 5 单克隆抗体后，流式细胞术测定 s P 细胞C D 5 5 的平均荧光密度值为1 0 0 8 5 - 4 - 4 5 7 ，M P 细胞C D 5 5 的平均荧光 值为5 0 5 1 - 4 - 4 7 5 ；C D 5 5 单克隆抗体标记未分选的M C F 7 细胞，流式细胞仪 分析C D 5 5 K g 细胞比例为2 1 2 - - ：0 3 9 。 3C D 5 5 h i g 和C D 5 5 l 删细胞接种后6 h 、1 2 h 和1 8 h ，贴壁率分别为 2
