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1、四川大学 硕士学位论文 乳酸菌素产生菌的筛选及其发酵产物性质的初步研究 姓名：田宇 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：王忠彦 20040410 感型) ： 绿脓杆菌( P s e u d o m o n a s p y o c y a n e a ) ； 大肠杆菌( E s c h e r i c h i ac o P ) ； 枯草芽孢杆菌( B a c i l l u ss u b t i l i s ) ： 伤寒杆菌( S h i g e l l ad y s e n t e r i a e ) ； 痢疾杆菌( S a l m o n e l l at y p h i ) ；
2、酿酒酵母( S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ， 黑曲霉( A s p e r g i l l u sn i g e r ) ： 白地霉( G e o t r i c h u mc a n d i d a e ) ； 后五者为本实验室保存其余均为成都药检所提供。 2 实验方法 2 1 乳酸菌素效价的测定。”1 由于该抗生物质尚在研究阶段，没有标准品做参照，故以硫 酸庆大霉素作为对照，制作硫酸庆大霉素的标准曲线，乳酸菌素 效价以对绿脓杆菌具有相同抑菌效果的硫酸庆大霉素标准品的效 价定义。 2 1 1 指示菌的制备 用l O m L 生理
3、盐水将一支3 7 培养过夜的P s e u d o m o n a s p y o c y a n e a 斜面细胞洗下制成蔚悬液。 2 1 2 测定平板的制备 采用双层平板。下层：1 5 水琼脂培养基l O m L 。上层：l O O m L 测定培养基分装到2 5 0 m L 三角瓶，置4 86 C 水浴保温。向每l O O m L 测定培养基中加入指示菌悬液l m L ，摇匀，l O m L 平m l 甫E j 成测定 平板。 2 1 3 测定方法( 一剂量法) 2 1 3 1 标准曲线的绘制 1 ) 配制6 0U m L 、7 0U m L 、8 0 U m L 、9 0U m L 、
4、1 0 0U m L 、 1 1 0U m L 、1 2 0U m L 、1 3 01 3 m L 、1 4 0U m L 、1 5 0U m L 的 硫酸庆大霉素标准溶液。 2 ) 取制备好的测定平板l o 套，每个测定平板中均匀放置6 个牛津杯( 1 0 8 6 e m ) ，每间隔的3 个牛津杯放O 3 m L 1 0 0 U m L 中间浓度硫酸庆大霉素标准品，其余3 个牛津杯 放o 3 m L 同一浓度标准硫酸庆大霉素标准溶液，每一浓度 做兰个重复。全部平板用瓦盖盖住，置于3 76 C 培养箱中培 养1 5 小时，测定抑菌圈直径。 3 ) 将上述3 0 个平板中3 0 个1 0 0
5、U m L 中问浓度硫酸庆大霉素 标准品的抑菌圈赢径的平均值作为标准曲线的校正点，将每 个浓度所得的平均值校正成适当的数值。 4 ) 以上述l O 个浓度的硫酸庆大霉素标准溶液校正后的抑菌圈 直径( m m ) 为纵坐标，相应的浓度对数为横坐标，在双周 半对数坐标纸上绘制标准曲线。或将上述数据以D = ai s C + p 进行回归，其中：D 为抑菌圈宣径( 瑚 ，C 为掷制夯浓度 ( U m L ) ，d 、1 3 为常数。 图1 标准曲线中牛津杯的排列位置照片 ( C o 为中心浓度，C k 为其它浓度) 2 1 4 发酵液效价的测定 将发酵液按标准曲线制备方法进行加样，每一浓度做三个重
6、复。置于3 7 。C 培养箱中培养1 5 小时，测定抑菌圈直径。对照标 准曲线计算发酵液效价。 3 乳酸菌素产生菌的筛选与鉴定 3 1 有抑菌活性菌株的筛选与鉴定 3 1 1 有抑菌活性菌株的初筛“训 初筛采用纸片法。将样品用无菌水适当稀释，取一定量涂布 于固体筛选培养基。3 06 C 倒置培养7 2 h ，待长出菌落后用灭菌牙签 挑取单菌落接种于加有l m L 筛选培养基的1 5 m L 离心管( E p 管， E p p e n d o r f t u b e ) 中，密封，3 0 “ C 静置培养7 2 h 。1 0 ，0 0 0r m i n 离心l m i n ， 取发酵上清液2 0
7、 乩于三层直径为5 r a m 灭菌纸片，在抑菌活性检 测用培养基中顺置3 0 分钟后于3 7 培养箱中倒爱培养1 5 h ，挑取 纸片周围具有较大抑菌圈及发酵产物具有广谱抗性的菌株进行复 筛。 0 0 0 0 一灭菌 直径5 越m 豹 l 吸取上 三层纸片 清液 零等可号 在E p 管内 3 7 倒置- 培养1 5 h o 测定平板 选取纸片周围有明显 抑菌圈的菌株，记录 图2 有抑篮作用菌株韵筛选流程 静置3 0 r a i n 图3 抗生物质产生菌的初筛方法( 纸片法) 照片 3 1 2 有抑菌活性菌株的复筛 复筛采用杯碟法。将初筛菌株咀划线法进行纯化，保藏。将 纯化保藏后的初筛菌种接入
8、装有1 5 0 m L 筛选培养基的1 5 0 m L 三角 瓶中活化7 2 h ，按1 的接种量按入装有2 5 0 m L 筛选培养基的 2 5 0 m L 三角瓶中，3 0 。C 静置培养4 8 h 。将发酵液以3 0 0 0r m i n 离心 1 0 m i n ，以杯碟法测定各菌株发酵上清液抑菌活性。 3 1 ，3 酸及酸性末端产物作用的检测与排除溆，3 2 1 发酵液对指示菌的抑制作用可能是乳酸菌素也可能是酸。为 了排除酸及其它酸性末端产物的干扰，用1 N 的N a O H 和1 N 的 H C I 将H F 0 8 离心发酵上清液中和至p H 3 5 、4 0 、45 、5 0
9、、5 5 并设p H 5 0 的乳酸作对照，而后做对指示菌的抑菌实验。 3 1 4 过氧化氢作用的检测。“ 发酵液对指示菌的抑制作用也有可能是发酵过程中产生了过 氧化氢。为了排除过氧化氢的干扰，采用过氧化物酶法对I - I F 0 8 菌 株进行发酵过程中过氧化氢产生的检测。 3 1 5 菌种的初步鉴定 采用形态观察和生理生化实验相结合的方法，根据文献 2 0 和 2 1 进行特性鉴定，并以伯杰细菌鉴定手册( 第八版) 2 1 作为 分类参考。 3 1 6 扫描电镜的制片方法”“”1 1 ) 菌液用0 I M 磷酸盐缓冲液( P B S ) ( p H 72 ) 洗三次。 2 ) 后一次悬于适
10、量P B S 中，浓度以滴在3 4 毫米2 小玻片 上密度均匀菌落不互相重叠为宜( 稍多为宣，因为在固定 相脱水过程中要掉许多) 。 3 ) 在3 4 毫米2 小块盖片上，铺放F o r m v r a 膜( 方法同超薄 切片) ，3 7 干燥。 4 ) 将菌悬液，稀释到适当浓度后，滴在铺有F o r m v r a 膜的小 玻片上，室温静置十分钟，将多余细胞悬液吸去。 5 ) 面朝上，把小玻片放入小称量瓶底部，用吸管沿瓶壁缓慢 加入I 冷却的戊二醛溶液，加的量只要淹过样本即可，4 固定2 小时以上，可过夜或更长时间。 6 ) P B S 洗三次。 7 ) 随即加1 四氧化锇，固定3 0 分钟
11、( 亦可2 3 小时) 。 8 ) 用P B S 洗三次。 9 ) 逐级脱水：5 0 7 0 ，9 0 丙酮各一次，1 0 0 两次，每次5 1 0 分钟。 1 0 ) 用醋酸异戊酯取代丙酮，程序为：5 0 ，7 0 ，9 0 醋酸异 戊酯丙酮溶液各一次，1 0 0 两次，时间与丙酮相同( 各 级醋酸异戊酯用1 0 0 丙酮配制而成) 。 4 11 ) 放入临界点干燥仪进行干燥。 1 2 ) 以碳、金分别喷镀。 取出洋本，扫描电镜观察( 如不能立即观察，则应继续保存在真 空条件下或干燥器内) 。 3 1 7 抗茵谱分析 采用液体扩散法( 管碟法) ，将 球0 8 菌株的发酵液离心，取 0 3
12、m L 上清液置于不同供试菌平板上的牛津小杯中，于供试菌的生 长温度下培养 8 2 4 h ，或者更长时间，观察有无抑菌圈出现以及 抑菌圈大小。 4 发酵条件的研究 4 1 发酵时间与抗菌活- 眭的关系 为了测定I - I F 0 8 菌株发酵液抑菌活性最高的时段，以绿脓杆菌 ( P s e u d o m o n a sp y o c y c t n e a ) 为指示茁( 以下同) ，将I - I F 0 8 菌株接种 子M R S 培养基中，1 0 0 m L 三角瓶装l O O m L 培养基，3 0 静置培 养7 2 h ，以L 的接种量转种进行二级扩大发酵，2 5 0 m L 三角
13、瓶装 2 5 0 m L 培养基，3 0 静置培养，从2 4 h 起，每隔1 2 h 取样离心取 上清液以管碟法做抑菌试验，以二级发酵时间( h ) 为横坐标，相 对效价( ) 为纵坐标，制作H F 0 8 菌株的抑菌活性时程曲线。 4 2 单因素实验 测定不同的碳源、氮源、起始p H 、摇瓶装量、培养温度、培养 时间、培养方式和接种量对抑菌活性的影响。 43 正交实验”蚓 为了了解培养基主要成分对菌株代谢产生揶菌活性物质的影 响，选取了培养基中的三个主要成分：碳源和两种氮源物质迸行 三因子三水平的正交实验，选取L 9 ( 3 4 ) 正交表。 对一剂量法标准曲线进行线性回归分析，回归方程为
14、D = 2 68 0 9 1 9 C 一3 l9 3 3 ，其中1 0 0 U m L 的硫酸庆大霉素为中心浓度， D 为抑菌圈直径( m m ) ，C 表示硫酸庆大霉素浓度( U m L ) ，线性 范围为6 0 一1 5 0 U m L ，线性相关系数R = 09 9 7 ，表明一剂量法标准 曲线有很好的线性关系。 2 乳酸菌素产生菌的筛选与鉴定 2 1 菌种的分离与筛选 样品经选择性培养基培养后生长大量菌落，在长出5 0 l o o 个单菌落的平板上共挑取了4 5 6 株典型菌株接入E p 管中进行抗生 物质产生菌的筛选，供试菌为金黄色葡萄球菌A 3 0 l f S t a p h y
15、l o c o c c u s a u r e l t sA 3 0 1 ) 、金黄色葡萄球菌A 3 0 9 f S t a p 觚l o c o c c u s a u r e u sA 3 0 9 ，青霉素敏感型) 、绿脓杆菌 ( P s e “d o m o n a s p y o c y a n e a ) 、大肠杆菌( E s c h e r i c h i ac o l i ) 和枯草芽孢 杆菌( B a c i l l u ss u b t i l i s ) 。经培养，在大薰纸片周围出现不同童径的 抑菌圈，其结果见表3 ，表4 ，表5 。 表3 有抑菌作用的菌株筛选结果 项目
16、发酵产物对五种致病菌都有抑制作用的菌株数( 株) 发酵产物对四种致病苗有抑制作用的菌株数( 株) 发酵产物对三种致病菌有抑制作用的菌株数( 株) 发酵产物对二种致病菌有抑制作用的菌株数( 株) 发酵产物对一种致病菌有抑制作用的菌株数( 株) 阳性菌株数( 株) 从平板中挑出进行检测的菌株数( 株) 从出发菌中筛出有抑菌作用菌株的比率 目一8 7 6 3 强 艳 誓煳鹞盯叭伯溺螂 表4 发酵产物对指示菌有抑制作用的菌株数目统计及分析 项目 数目( 株)检出率 对金黄色葡萄球菌A 3 0 1 有抑制作用的 1 4 03 0 7 菌株 对金黄色葡萄球菌A 3 0 9 育抑制作用的菌 1 6 l3 5 3 9 6 株 对绿脓抨菌育抑制作用的菌株 2 6 05 7 对大肠杆菌有抑制作用的菌株 1 8 34 0 1
