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1、密级： 分类号： 丹酚酸 l80 5 732 单位代码： 8 4 5 0 2 学号：2 Q Q 2 Q 世丑 中国中医科学院 2 0 0 7 级硕士研究生学位论文 A 干预心肌缺血再灌注损伤 的钙相关机制研究 E f f e c ta n dC a l c i u mM e c h a n i s m o f S a l v i a n o l i c A c i dAo n M y o c a r d i a l I s c h e m i a R e p e r f u s i o nI n ju r y 申请人：王宝 专业：中西医结合基础 研究方向：心血管药理学 导师：刘建勋研究员 中国
2、中医科学院西苑医院 - 0 - - 0 年五月北京 原创性声明 f l l l llrlI II l lI l l r l r lr l l t l lI l l f 17 7 8 7 4 9 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师的指导下注明引用的内容外， 不包括任何其他已经发表的科研成果。对本文研究作出重要贡献者，已在文中以 明确方式表明。本声明的法律责任完全由自己承担。 叮，2 论文作者签名蔓= _ ；厶一一 导师签名 关于学位论文使用授权的说明 本人完全知道中国中医科学院有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留 或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授
3、权中国中医科学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名量竺 目录 中文摘要1 A B S T R A C T 3 英文缩略词表5 综述一心肌缺血再灌注损伤的研究概况7 综述二中药对心肌细胞钙离子通道作用的研究与展望1 7 前言：2 5 刖百：z ) 实验部分一丹酚酸A 对缺氧复氧心肌细胞活力的影响2 6 材料与方法一2 6 实验结果2 9 讨论。：31 J 、结3 1 实验部分二丹酚酸A 对大鼠心肌细胞L 一型钙通道的阻滞作用3 2 材料与方法吖3 2 结果。3 6 讨论
4、5 0 J 、结5 1 实验部分三丹酚酸A 对心肌细胞内游离钙离子浓度的影响5 2 材料方法5 2 结果5 5 讨论6 0 J 、结6 1 结语6 2 参考文献6 3 致谢6 7 个人简历。6 8 丹酚酸A 干预心肌缺血再灌注损伤的钙相关机制研究 中文摘要 丹酚酸A 干预心肌缺血再灌注损伤的钙相关机制研究 丹酚酸A ( S A A ) 是唇型科植物丹参的水溶性部分丹酚酸中的主要化学成分 之一，由一分子丹酚素和三分子咖啡酸缩合而成。本实验室课题组最近研究发现 S A A 具有抑制缺氧复氧诱导心肌细胞L D H 漏出的作用，这为S A A 发挥抗心肌 缺血再灌注损伤作用提供了细胞水平上的依据。本课
5、题为阐明它这一保护作用的 机制，首先通过建立体外缺氧复氧心肌细胞模型来模拟心肌缺血再灌注损伤并应 用M T T 实验的方式，观察了S A A 对心肌细胞活力的保护作用。尽管L _ 型钙通 道的大量开放是造成钙超载的重要原因，但丹酚酸A 对心肌细胞L 一型钙通道的 影响作用至今未见报道，因此实验部分二采用全细胞膜片钳技术来研究S A A 对 心肌细胞L 型钙通道电流及其动力学过程的影响作用，与此同时我们还应用活 细胞自动成像系统来验证了S A A 对心肌细胞内钙离子浓度的影响作用，进一步 探索其抗心肌缺血再灌注损伤作用的钙离子机制。 实验部分一丹酚酸A 对缺氧复氧心肌细胞活力的影响 目的研究丹酚
6、酸A 对缺氧复氧心肌细胞活力的影响 方法S y n e r g y T M 4 多功能微孔板检测系统测定O D 值。 结果与正常组比较，模型组心肌细胞O D 值明显降低( P O 0 5 ) ；应用5 0 “m o l L S A A 后可抑制K C l 去极化所引起的心肌细 胞内钙离子浓度升高的幅度，S A A 组虽然可见F F o 值的升高，但升高幅度明显 的低于对照组( n 一3 ，P O 0 5 ) ，K 由( 2 6 5 0 0 2 ) 变为( 2 8 5 0 0 1 ) ( n = 6 ，P O 0 5 ) ( 图2 1 9 ，2 2 0 ， 2 2 1 ，2 2 2 ) M 一，
7、 1 0 0 0 m q 2 0 0 m s O m V - 4 0 m V 图2 1 9 失活曲线刺激波形 厂一 亭P 目1 2 2 0 典型钙通道失活电流 丹酚酸A 干预心肌缺血再灌注损伤的钙相关机制研究 1 O 0 8 O 6 E S0 4 O 2 0 0 - 2 01 0 01 0 C o n d i t i o n i n gp o t e n t i a l ( m Y ) 图2 2 1S A A l 0um o l L 对钙电流失活曲线的影响 1 0 0 6 田 E S0 4 0 2 2 01 001 0 M e m b e r a n c ep o t e n t i a lm
8、 V 图2 2 2S A A l 0 0um o l L 对钙电流失活曲线的影响 4 7 中国中医科学院2 0 0 7 级硕士研究生学位论文 5 5 丹酚酸A 对失活后恢复曲线的影响 采用双脉冲刺激，保持电压为一4 0 m y ，条件脉冲去极化至O m v ，持续2 0 0 m s ，再 给以1 0 m V 测试脉冲，两脉冲的间隔时间依次为0 ，4 0 ，8 0 ，1 6 0 ，3 2 0 ，6 4 0 ，1 2 8 0 m s 。 应用单指数方程对数据进行拟合：I t I p 心娟+ A e X p T 为时间常数。 S A A l 0 m o l L 使I C a L 的恢复时间T 由给药
9、前的( 1 1 1 7 1 1 1 ) m s 变为( 1 2 7 6 5 1 2 4 5 ) m s ( n 2 6 ，p O 0 5 ) 。S A A I O 4 m o l L 使I - C a L 的恢复时间T 由给药前的 ( 2 1 5 4 5 _ _ _ 2 9 8 8 ) m s 变为( 2 0 8 5 7 - - + 2 8 8 7 ) m s ( n = 6 ，p O 0 5 ) ( 图2 2 3 ，2 2 4 ， 2 2 5 ，2 2 6 ) 。 2 0 0 m s 1 0 m V 2 0 0 m s O m V 一4 0 m V Tm s 图2 2 3 彗：箨 ；斥i 恢
10、!乏曲线的j列激波形 一 - _ ，r y f 7， 厂厂 f虱2 2 4 典型钙通道失活后恢复电流 丹酚酸A 干预心肌缺血再灌注损伤的钙相关机制研究 芑 璺 j o 刁 o 丝 面 E o 1 - 1 0 0 6 O 4 O 2 0 0 - 2 0 00 2 0 04 0 06 0 0 8 0 01 0 0 01 2 0 01 4 0 0 t i m e m s 图2 2 5S A A l 0 1 1m o l L 对钙电流失活后恢复曲线的影响 1 2 1 O 0 8 0 6 O 4 O 2 O O - 2 O 2 0 04 0 06 0 08 0 01 0 0 01 2 0 01 4 0
11、0 T i m e m s 图2 2 6S A A l 0 0pm o l L 对钙电流失活后恢复曲线的影响 4 9 毋coJJ30口oN=西cJJoZ 中国中医科学院2 0 0 7 级硕士研究生学位论文 讨论 1 S D 大鼠心室肌细胞的分离 关于心室肌细胞的急性分离，有大家公认的注意事项，在此不再赘述，每个 实验室也有自己的经验，但就影响实验成败的关键环节多未祥于报道，致使初次 从事此研究的实验人员需要进行较长时间的摸索才能成功。根据我们方法建立成 功的经验总结如下：( 一) 液体灌流过程中，离体心脏暴露的周围环境温度是一 个很重要的参数，我们曾在其它条件一定的情况下作过比较：如果心脏暴露
12、的环 境温度在2 79 C ，那么分离所得的存活细胞在8 0 以上，再次用正常台式液灌流后， 耐钙细胞数在7 0 以上；如果心脏暴露的环境温度在2 2 。C ，那么分离所得的存活 细胞在7 0 左右，再次用正常台式液灌流后，耐钙细胞数在6 0 左右；如果心脏 暴露的环境温度在1 9 。C 以下，那么分离所得的存活细胞在3 0 以下，再次用正常 台式液灌流后，几乎得不到耐钙细胞。温度过低必将加剧细胞的耗能，尤其对心 脏外层的细胞影响更大，最终导致细胞的死亡：( 二) 水的质量非常的重要，一 定要用超纯水或去离子水，要求水的电导在lus c m 以下。我们曾经用过双蒸水 和纯净水，细胞质量均不合格
13、：( 三) 心脏的摘取，主动脉的保留长度一定要足 够，一般应在3 m m 以上，同时要保留肺动脉及其动脉附件的完整：( 四) 灌流装 置一定要注意排除气泡，换用液体时要关闭蠕动泵，以防止气泡进入心脏造成死 腔而使灌流不充分导致细胞死亡：( 五) 酶液灌流的时间应该根据自己的实验条 件设置，一般是在酶液灌流过程中心脏突然变软时所得计时数左右调整”1 2 1 。时 间过长分离所得细胞的体积会变大，同时耐钙性也不好。时间过短，分离不充分， 同样得不到合格细胞。而酶液中钙离子浓度应该是越低越好，我们的经验是3 0 um m o l L ，这个浓度足以满足消化酶活性激活所需，同时也有利于预防钙反常【1 3 】 ( 六) 氧气的选择，我们的经验是9 9 以上的医用氧。我们曾经用过9 5 0 2 + 5 C 0 2 的混合气，发现通气五分钟后，液体P H 值由7 3 变为7 1 6 ，明显不符合细胞外 环境要求。 2 丹酚酸A 对L 一型钙通道电流的影响 关于心室肌细胞L 型钙通道电流的记录，我们将钳制电压设定为- 4 0 m V ，这 样就能排除T 型钙通道和钠通道电流的影响，同时
