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1、中国人民解放军军医进修学院 硕士学位论文 基于胞间通讯的肿瘤化疗敏感试验 姓名：缪力 申请学位级别：硕士 专业：骨外科学 指导教师：刘郑生;蔡谞 20040501 硕士学位论文军医进修学院 英文缩写一览表 G J I C 间隙连接介导的细胞间通讯 ( g a pj u n c t i o n a L i n t e r c e iju l a r c o 哪u n i c a t i o n ) C X 一连接蛋白 ( c o n n e x i n ) C L S M 一激光扫描共聚焦显微镜 ( c o n f o c a l l a s e r s c a n n i n g m i c
2、r o s c o p e F R 蠢蠢一荧光光淬灭( 光漂白) 恢复技术 ( f l u o r e s c e n c e r e d i s t r u b u t i o n a f t e rp h o t o b l e a c h i n g ) M T T 一一一一四苯基氮唑兰 D M S O 一一二甲基亚砜 A D M 一一一一阿霉素 V C R 一长春新碱 硕士学位论文 军医进修学院 基于胞问通讯的肿瘤化疗敏感试验 摘要 研究目的：本研究通过从一个与以往化疗药敏试验不同的新 角度，在细胞生物学反应信号的调控水平探讨骨恶性肿瘤细胞间 通讯改变与其对化疗敏感性之间的相关性，从而
3、为发现一种准确、 简便、灵敏、快捷的骨肿瘤化疗药物敏感试验新方法奠定实验基 础。 对象和方法：自临床选择既往来接受化疗的经病理证实为 骨恶性肿瘤的患者8 例，采集其手术或活检的无菌肿瘤标本进行细 胞培养。培养好后将细胞传入孔板中，将五种常用药物( 阿霉素、 长春新碱、顺铂、丝裂霉素、氨甲喋呤) 按三个终浓度等级加入 后应用荧光光淬灭( 光漂白) 恢复技术。通过激光扫描共聚焦显 微镜枪测胞间通讯的恢复率( 实验组) 并用计算机处理所得数据。 将所得数据与在同样条件下行M T T 法所得的结果( 对照组) 进行对 比。最后应用统计学方法对两组实验结果进行相关性分析。 结果：在终浓度为c m a x
4、 5 的条件下，实验组中五种药物的胞 间通讯均有不同程度的恢复，对照组五种药物均对肿瘤有不同程 度敏感性，其中阿霉素、顺铂和氨甲喋呤实验组和对照组的结果 旱明显相关( r O 7 6 ，p O 7 6 ，p O 0 5 ) b e t w e e n t h e0 w og r o u p si nA D M 、D D Pa n d M T X ， t h e r ew e r en om a r k e d l y c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h et w og r o u p si no t h e rt w od r u g s I 九 t h
5、 ec o n d i t i o no ff i n a lc h r o m aw a sC m a x 丰l ，t h e r ew e r e o b v i o u s l yc o r r e l a t i o nb e t W e e nt h et w og r o u p si nD D P I nt h e c 。n d l t i o no ff i n a Ic h r o 1 aw a s ( = l T l a x 术O 2 。t h e r ew e r en oe v i d e n t r e s u m eo fG J I Ci na 11t h ef i
6、 v ek i n d so fd r u d si n t h e e K p e r 孔m e n t a lg r o u p ，t h o r ew e r es o m es e n s l t i V i t yL ot h et u m 。r ina l1t h ef i v ek i 九d so fd r u g si nt h ec o n t r o lg r o u p t h e r e 钾o r en oe v d e n tc o r r e l a t i o no ft h er e s u lt si nt h ef i v ed r u g s b o L
7、w e e nL h et w og r o u p s C o n c l u s i o nA t p r e s e n t ， t h e r ew e r el o t so fd i f f e r e n t C h e m 。s e n s i t i v i t yt e s to fb o n et u m o r ， b u te V e r yo n eh a df t s o w nl i m i t a t i o n t h eG J l Co fb o n et u m o rw a sr e s t r a i n e da n d d e s c e n d
8、 e da n dt h ec h e m l ct r e a t e dd r u g sc o u l dr e s u H j e I t s r 。s tr a i na n dd e s c o n d W eh a v eg a i n e ds o m es a t i s f y jn gr e s u l t s 硕士学位论文军医进修学院 i no u re x p e r i m e n tb ym e a s u r i n gt h er e s u m eo ft h eG J I Ca n d s t u d y i n gt h ec o r r e l a t
9、 i o nw i t ht h eM T T B e c a u s eo fit ss i m p l e ， s e n s i t i v ea n ds h o r t c u t ， t h eG J I Cc o u l db eaw e l lm e a n st o d i r e c tt h ec l i n i cc h e m i ct r e a t m e n t As t u d y i n go fm o r ek i n d s o f d r u g s a n d l a r g es a J n p l e s w a sn e c e s s a r
10、 yt oe s t a b l i s ha p e r f e c t ， c r i t e r i o na n d h i g hr e l i a h i l i t y b a s ef o r t h e c h e m o s e n s i t i v i t yt e s to fb o n et u m o r K e yw o r d s c h e m o s e n s i t i v i t y t e s tb o n em a l i g n a n c y G C 姗tm e t h o d 7 硕士学位论文 军医进修学院 某些促癌拮抗剂或抗肿瘤化疗药物的
11、作用下，肿瘤细胞间通讯可 能在一定程度上得以恢复和增强，从而阻断肿瘤细胞的增殖和肿 瘤的进一步生长，并削弱其转移能力m3 。因此，推测胞间通讯的 改变与肿瘤细胞对某种化疗药物的敏感性之间应存在定的相关 性。目前检测胞间通讯的方法有代谢协同法、荧光素转移法、电 偶联测定、缝隙连接结构分析以及c o 肌e x i n 基因表达分析等，其 中以前两者最为普遍。尤其是9 0 年代以来，由于新一代强有力 的医学生物学研究工具激光扫插共聚焦显微镜( c 。n f o c a l 1a s e r s c a n n i n gm i c r o s c o p e ，c L s M ) 的应用，使基于荧光
12、光淬灭 ( 光漂白) 恢复技术( f l u o r e s c e n c er e d i s t r u b u t i o n a f t e r p h o t 。b l e a c h i n g ，F R A P ) 检测方法更为直接、简便和快捷，通过 计算机处理，可获得胞间通讯的可靠数据，从而为科研统计提供 了科学的依据“。 本文旨在通过荧光光淬灭( 光漂白) 恢复技术检测体外骨恶 性肿瘤细胞在加入不同化疗药物后胞间通讯的改变，并同传统的 M T T 法进行对照性研究，对两者的结果进行相关性分析并加以讨 涂。 硕士学位论文 军医进修学院 对象和方法 一、对象和材料： 1 、标本
13、来源： 自临床选择既往未接受化疗的经病理证实为骨恶性肿瘤的患 者9 例，采集其手术或活检的无菌肿瘤标本进行细胞培养其中4 例培养失败。培养成功的5 例和3 例解放军总医院骨研所提供的 骨恶性肿瘤细胞系共8 例做为实验对象。其中成骨肉瘤4 例、软 骨肉瘤3 例、滑膜肉瘤1 例。 2 、主要试剂和材料： 荧光染料6 一c F D A A M ( 美国s I G M A 公司) ；i o 热灭活胎牛血清 ( 北京亨利公司) ：D 她M 培养基( 美国s I G i A 公司) ；D M s o ( 美 国s I G M A 公司) ；四苯基氮唑兰( M T T ) ( 美国s I G M A 公司)
14、 ；9 6 孔 及2 4 孔培养板( 英国c o R N I N G 公司) ； 3 、主要仪器： 激光扫描共聚焦扫描显微镜( 美国B I O R A D 公司) ；M l ( I I I 型 酶标仪为( 芬兰w E L L s c A N 公司) ：3 7 ，5 c 0 2 孵箱( 美国V E c O t ? 司) ；倒置显微镜( 日本0 L Y M P u s 公司) 硕士学位论文 军医进修学院 二、研究方法： 1 、骨恶性肿瘤的标本采集和细胞培养 l 、l采集骨恶性肿瘤的患者手术或活检的无菌肿瘤标 本，采用解放军总医院骨研所黄靖香主任发明的纱巾法进行细胞 培养。在超净台中剪碎肿瘤组织并经
15、l 型胶原酶进行消化后，分 散铺于培养瓶纱巾上，置入3 7 ，5 9 6 c 0 2 孵箱培养，培养基为含 l o 热灭活胎牛血清的D 舾M 培养液。 1 、2 骨恶性肿瘤细胞系的细胞进行复苏后直接在含1 0 热灭活胎牛血清的D 忱M 培养基中培养、传代。 2 、培养后恶性肿瘤细胞的鉴定 经染色体染色鉴定，正常染色体为4 6 条，肿瘤细胞可见 到多倍体。( 见附图) 3 、加入化疗药物后在荧光光淬灭恢复技术下细胞胞间通讯的 检测 3 1 将培养好的细胞传入2 4 孔板中继续培养，待细胞数 达到孔底面积的7 0 8 0 时，依次按三个终浓度等级( c m a x 4 5 、 c m a x “、
16、c m a x O 2 ) 将阿霉索( A 蹦) 、长春新碱( V c R ) 、顺铂( D D P ) 、 丝裂霉素( c ) 、氨甲喋呤( M T x ) 加入孔巾。终浓度按照临床最大 硕士学位论文 军医进修学院 血药浓度推算体外用药剂量( c m a x 1 ) 分别为阿霉素：O 4 “m l ， 长春新碱：O 5 蚓m 1 ，顺铂：3 蚓m l ，丝裂霉素：3 删m l ，氨甲喋呤 4 灶m l 。另设空白对照组及背景校正组。加药后将2 4 孑L 板置入 3 7 ，5 9 6 C 0 2 孵箱继续培养8 小时。 3 26 C F D A M 粉剂溶于二甲基亚砜( D M S 0 ) 中配 成1 m m l 的储存液，一2 0 保存。将培养好的细胞先用P B S 液清 洗2 次
