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1、中山大学 硕士学位论文 基于聚乙烯亚胺为骨架的基因传递系统的制备及体内外性能研 究 姓名：温玉婷 申请学位级别：硕士 专业：药剂学 指导教师：潘仕荣 20080513 中文摘要 基于聚乙烯亚胺为骨架的基因传递系统的 制备与体内外性能研究 专业：药剂学 方向：药物新剂型与新技术 硕士研究生：温玉婷 导师：潘仕荣教授 摘要 聚乙烯亚胺( p o l y e t h y l e n i m i n e ，P E I ) 是目前研究最为广泛的阳离子聚合物非 病毒基因载体。大分子P E I 如P E I2 5 k 具有强的缓冲能力，能有效压缩D N A ， 在体外具有较高的转染效率，但所形成复合物不稳定
2、，容易聚集，毒性较大，不 可降解，长期使用可造成毒性积聚，所以不适合于体内应用。P E l 分子量低于2 0 0 0 时不显细胞毒性，但小分子P E I 不能很好地压缩D N A ，与D N A 通过静电作用仅 能成为一个很大的聚集体。转染效率非常低，仅与裸D N A 相若，所以单纯的小 分子P E I 不能作为基因载体。 基于大分子P E I 和小分子P E I 应用为基因载体时的特性，本研究设计把多个 无毒性的小分子P E I4 2 3 接枝至聚乙二醇聚谷氨酸主链上，改造成可降解的大分 子P E I 衍生物P E G b P L G g P E I 。聚乙二醇嵌段可提高聚合物D N A 复
3、合物的稳 定性，延长基因在血液循环中的半衰期。聚合物可被生物降解，降解位点聚谷氨 酸的肽键。聚合物中聚乙二醇嵌段，聚谷氨酸嵌段和聚谷氨酸每个单体单元上的 小分子P E I 细胞毒性均较低。由该设计思路所制得的聚合物可能成为毒性低但转 I I I 中文摘要 染效率高的基因载体。 冠心病病人冠脉狭窄通常使用经皮冠状动脉腔内成形术( P T C A ) 对狭窄冠 脉进行介入性治疗，但是术后发生再狭窄机率高。V E G F l 6 5 基因是被公认为可 促进内膜修复，促进内皮细胞生长从而防治P T C A 术后再狭窄的基因。但是目前 V E G F l 6 5 基因治疗血管成形术后再狭窄的研究中所用基
4、因载体一般为病毒载 体，病毒载体存在严重的安全性问题；或者是直接给予裸D N A 进行治疗，但这 样转染效率低。也就是说，暂时没有找到适合的基因载体介导V E G F l 6 5 进行血 管成形术后再狭窄防治。本研究选用所合成的聚合物P E G b P L G g P E I 介导 V E G F l 6 5 进行防治血管成形术后再狭窄的基因载体，考察其体内治疗兔左侧颈 总动脉血管成形术后再狭窄的疗效。 本研究利用聚谷氨酸为骨架，将多个小分子P E l 4 2 3 链接成可降解的大分子 P E I 衍生物，并引入P E G 嵌段，制得聚合物P E G b P L G g P E I 。本文主要
5、考察所 合成聚合物P E G b - P L G g - P E I 的毒性和生物降解性能；P E G b - P L G g P E I D N A 基因传递系统的物理化学性能及生物学性能。同时考察该传递系统的体外转染效 率及体内防治血管成形术后再狭窄的疗效。本文主要讨论以下几方面的内容： ( 1 ) P E G b P L G g P E I 的合成与表征 以氨基聚乙二醇单甲醚引发聚谷氨酸苄酯羧酸酐( B L G N C A ) 制得聚乙 二醇聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物( P E G b P B L G ) ，并以小分子P E I4 2 3 对 P E G b P B L G 中P B L G
6、 嵌段进行氨解，把P E I 作为侧链接枝于聚谷氨酸主链上， 制成以小分子P E I 组成的三嵌段聚合物P E G - b P L G g - P E I 。由1 HN M R 可知，聚 合物P E G b P L G - g P E I 中P E I 的分子量可由由P L G 的链长决定；I R 、1 HN M R 、 1 3 CN M R 和D S C 证实聚合物含有P E G 嵌段，P L G 嵌段和P E I 嵌段的特征峰； C D 证明聚合物在有机良溶剂呈现a 螺旋构象，在水溶液中为无规线团构象；G P C 分子量分布图显示为单峰，结果显示聚合物P E G b - P L G g P
7、 E I 为共聚物而非混 合物。 ( 2 ) 聚合物P E G - b P L G - g - P E I 的生物降解性能研究 以粘度法测定聚合物P E G b P L G g P E I 在水解和酶解前后分子量的变化。 聚合物P E G - b - P L G g P E I 在模拟细胞外液( P B S ，p H = 7 4 ) 条件下可被水解，8 I V 中文摘要 天聚合物可降解2 0 ；在模拟体内酶环境下( 木瓜蛋白酶) 可被酶解，9 6 h 后聚 合物降解7 0 。在聚7 , - - 醇聚谷氨酸侧链引入阳离子P E I ，与引入非离子型小 分子相比，会降低聚合物的水解及酶解速度。P
8、E G b P L G g P E I D N A 复合物在 模拟细胞内内涵体环境( p H = 5 ) 条件下降解2 4h ，复合物水解2 4h 后D N A 的 检出量与不经水解2 4h 的复合物的D N A 检出量不显显著性差异，说明聚合物的 压缩复合D N A 的能力在2 4h 内未受其生物降解性影响。 ( 3 ) 聚合物P E G b P L G - g P E I 的毒性研究 以M T T 法考察聚合物的细胞毒性。由小分子P E I4 2 3 组成的聚合物 P E G b P L G g P E I 对H e l a 细胞的细胞毒性与小分子P E I4 2 3 细胞毒性接近， l
9、m g m L 的聚合物溶液在含血清或不含血清条件下培育3 0m i n 和4h ，细胞存活 率在7 5 以上，显著低于大分子P E I2 5 k 的细胞毒性。聚合物P E G b P L G - g P E I 的2 4h 和9 6h 的酶解产物均不显细胞毒性。分别测定聚合物P E G b - P L G - g P E I 在H e l a ，H e p G 2 ，B e l 7 4 0 2 和2 9 3 细胞中的I C 5 0 值，显示P E G b P L G g P E I 的 细胞毒性在上述四个细胞系的毒性均低于P E I2 5 k 。利用溶血实验考察 P E G b P L G
10、g P E I 的溶血毒性，聚合物浓度为3m g m L 时溶血率 G GI G G I4 0 G G I3 0 。即相同浓度的聚合物G G2 中聚谷氨酸的含量高 于G G1 、G G I4 0 和G G I3 0 。由1 HN M R 结果可知( 表2 ) ，G G2 分子量大于 G G1 ，同时因为同有一嵌段P E G5 k ，所以G G2 中聚氨基酸肽链含量更多。而 G G I4 0 与G G1 相比，由P E I4 2 3 取代原有的苄酯基，由于分子量P E I4 2 3 大于 苄酯基，核磁结果表明，P L G 链段比例小于G Gl 。由核磁结果表2 和表3 可知， P L G 比例在
11、上述四种聚合物的比例为G G2 G GI G G I4 0 G G I3 0 ，这与C D 的 结果一致。 由上述C D 结果可进一步证实大分子m P E G - N H 2 能引发B L G N C A 聚合成 P E G b P B L G 嵌段共聚物，小分子P E I4 2 3 通过氨解反应成功接枝在P B L G 嵌段 主链上。 图2 8 为三嵌段聚合物P E G b P L G g P E I ( G G I ) 以1 5 ( p H = 7 4 ) m MN a C I 溶液中所测定的C D 谱。由于G Gl 以及G G2 不溶于水，所以未能在聚合物水 溶液C D 图谱与G G I
12、3 0 、G G I4 0 对照。由图2 8 可知，聚合物G G I3 0 和G G I4 0 在1 5 0 m MN a C I 溶液中的C D 谱与其在二氯甲烷中的C D 光谱不同，在2 0 8a m 处和2 2 2 肌并未出现负峰，即聚合物G G I3 0 和G G I4 0 在水溶液中其聚氨基酸 主链并不呈现a 螺旋构象。两聚合物图谱类似，均在2 0 0n l r l 附近处出现低谷， 在2 1 0 2 2 0n l n 处出现一正椭圆，这是典型的多肽链呈无规卷曲构型的特征峰【8 0 8 3 】。由图谱可以说明，G G I3 0 和G G I4 0 在1 5m MN a C I 中呈无
13、规卷曲构型。这 是因为当聚氨基酸侧链接枝上小分子P E I 后，其侧链可在1 5m MN a C I ( p H = 7 4 ) 溶液中质子化，聚氨基酸只有当侧链不带电荷时才能形成a 螺旋构象。当聚氨基 酸侧链上相邻基团若带有同种电荷，会产生静电排斥力，从而阻止多肽链堆积成 Q 螺旋构象。接枝P E I 侧链的聚谷氨酸链段，几乎所有的侧链在p H = 7 4 时都可 质子化带上正电荷，邻近电荷之间的静电排斥力阻止螺旋的形成，因此使聚合物 呈现出一种伸展的构象而并非Q 螺旋构象。由此可从另一个角度证实，聚合物 G G I3 0 以及G G I4 0 其聚氨基酸链段侧链确实接枝有小分子P E I
14、，从而使其中的 聚谷氨酸多肽链在水溶液中不呈现Q 螺旋构象，而是呈现无规卷曲构象。 第2 章P E G b P L G g P E I 的合成与表征 口 o 它 妄 一 a U W a v e l e n g t hl n m ) 图2 8 三嵌段聚合物P E G - b - P L G - g P E I ( G G I ) 在1 5 0m MN a C I 中的C D 谱 F i g 2 8C Ds p e c t r ao f b l o c kt r i b l o c kc o p o l y m e rP E G - b - P L G g - P E I ( G G I ) i
15、n15 0m M ( p H = 7 4 ) a t 2 5 ( a ) G G I3 0 ( b ) G G I4 0 3 2 6 聚合物G P C 的测定 本文选用凝胶渗透色谱法( G e lP e r m e a t i o nC h r o m a t o g n u n ) 测定所合成聚合 物P E G b P L G g P E I ( G G I4 0 ) 的相对分子量及其分子量分布。图2 9 为聚合物 G G I4 0 的分子量分布图，可见曲线上G G I4 0 三嵌段聚合物分子量分布为单峰， 证明所合成的G G I4 0 为聚合物而并非混合物。聚合物的多分散性( p o l
16、y d i s p e r s i t y ) 约为1 1 2 ，P D I = M w M n ，G G I4 0 的P D 值接近1 ，证明聚合物分布较集中，分 布较均一。表4 为聚合物G G I4 0 测得的各种相对分子量。聚合物的数均相对分 子量为5 6 0 0 4 ，1 HN M R 根据峰面积计算所得的分子量为5 9 9 1 4 ，两者接近但不 一致。原因在于，G P C 测得的G G I4 0 的分子量是以聚乙二醇为标样的相对分子 量。由于标样聚乙二醇是线形的，而G G I4 0 为接枝聚合物，其在液体的流体力 学行为与线形的P E G 不一致，所以由线形的P E G 确定非线形的G G I4 0 会导致 偏差。同时G G I4 0 由于接枝了小分子P E I ，为阳离子聚合物，在水溶液中形成 双电层结构，所以测得的分子量还和
