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1、学校代号 10532 学 号 T08111005 分 类 号 密 级 博士学位论文 基于纳米材料信号增强的电化学 生物传感器研究 学位申请人姓名 王永红 培 养 单 位 化学化工学院 导师姓名及职称 何晓晓 教授 王柯敏 教授 学 科 专 业 分析化学 研 究 方 向 纳米尺度上的生命分析化学 论 文 提 交 日 期 2012 年 2 月 Study on Electrochemical Biosensors Using Nanomaterial as Signal Amplification by WANG Yonghong B.S. (Hunan University of arts an
2、d science) 2006 A dissertation submitted in partial satisfaction of the requirements for the degree of Doctor of Science in Analytical Chemistry in the Graduate School of Hunan University Supervisor Professor HE xiaoxiao and Professor WANG kemin Feb, 2012 学校代号： 10532 学号： T08111005 密级： 湖南大学博士学位论文湖南大学
3、博士学位论文 基 于 纳 米 材 料 信 号 增 强 的 电 化 学 生物传感器研究 学位申请人姓名： 王永红 导师姓名及职称： 何晓晓 教授 王柯敏 教授 培 养 单 位： 化学化工学院 专 业 名 称： 分析化学 论 文 提 交 日 期： 2012 年 2 月 论 文 答 辩 日 期： 2012 年 2 月 25 日 答辩委员会主席： 陈金华 教授 I 湖 南 大 学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和
4、集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 1、保密，在_年解密后适用本授权书。 2、不保密。 （请在以上相应方框内打“”） 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 基于纳米材料信号放大电化学传
5、感器的设计与研究 II 摘 要 电化学生物传感器由于灵敏度高、操作简便、免分离、选择性好、不需要样 品预处理等优点而受到研究者们的广泛关注。目前对于它的研究和应用发展十分 迅速，已广泛应用于工业过程控制、临床医学检测、环境监测、化学药品安全性 评价以及食品、制药等诸多领域。功能化纳米材料有着优异的化学和物理性能， 有着极高的比表面积，有利于增加敏感分子的吸附能力，并能提高生化反应的速 度，将功能化纳米材料应用于电化学生物传感器可以显著提高传感器的性能。近 年来，本研究小组结合纳米技术、分析技术、生物技术以及材料制备技术，开展 了以纳米材料信号放大的生命分析方法为核心的研究工作。本论文在大量文献
6、调 研的基础上，拓展了基于纳米材料的信号增强作用在电化学生物传感中的研究， 并主要开展了以下研究工作： 一、基于核酸适体探针和纳米胶囊信号放大作用电化学检测凝血酶一、基于核酸适体探针和纳米胶囊信号放大作用电化学检测凝血酶 结合核酸适体探针识别特性和纳米胶囊信号放大效应发展了一种高灵敏、高 特异性检测凝血酶的电化学方法。采用油水相界面自组装方法首次制备了包裹电 活性物质巯基二茂铁的纳米胶囊。将能特异性识别凝血酶的两条核酸适体分别修 饰在包裹巯基二茂铁的二氧化硅纳米胶囊和磁性微珠表面，当凝血酶存在时，纳 米胶囊和磁性微珠表面的核酸适体与凝血酶结合形成三明治结构复合物，并在外 加磁场的作用下实现三明
7、治结构复合物的分离富集，利用碱溶解作用释放出巯基 二茂铁信号分子，通过金-巯键作用吸附到电极表面，然后检测电极上二茂铁的电 化学信号，从而实现对凝血酶的检测。该方法利用了核酸适体的高亲和性，包裹 巯基二茂铁纳米胶囊的信号放大作用以及磁性微珠的快速分离富集作用，凝血酶 检测的线性范围为 0.1 nmol/L5 nmol/L，检测限为 0.06 nmol/L。利用该方法能 实现人血清白蛋白中凝血酶的检测。 二、基于单壁碳纳米管信号放大二、基于单壁碳纳米管信号放大作用作用电化学检测甲基化酶活性电化学检测甲基化酶活性 利用单壁碳纳米管的信号放大作用发展了一种高灵敏而又简便的测定甲基化 酶活性的电化学方
8、法。 首先将含 Dam MTase 特异性识别序列和甲基化敏感的限制 性内切酶位点的双链 DNA 修饰在金电极上，当 Dam MTase 和 Dpn I 内切酶存在 的时候，识别序列先后被甲基化以及切割成单链 DNA，从而使单壁碳纳米管可控 吸附到修饰电极上。而没有 Dam MTase 存在的时候，双链 DNA 因没有甲基化而 不能被 Dpn I 切割，单壁碳纳米管不能沉积在电极上。而沉积在电极上的单壁碳 纳米管可以加速电极和电活性物质之间高效率的电子转移， 产生高的法拉第电流， 电流大小与 Dam MTase浓度相关。 由于单壁碳纳米管的信号放大作用， Dam MTase 的线性响应浓度范围
9、为 0.1 U/mL 至 1.0 U/mL， 检测限为 0.04 U/mL。 该方法简便， 博士学位论文 III 灵敏，为非放射性检测甲基化酶活性提供了一种新的方法，并且可以实现对甲基 化酶抑制剂的筛选。 三、基于二茂铁衍生物修饰的单壁碳纳米管电化学检测三、基于二茂铁衍生物修饰的单壁碳纳米管电化学检测 T4 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 利用钛离子的介导作用以及二茂铁修饰单壁碳纳米管的信号放大作用，发展 了一种新型的用于检测T4 多聚核苷酸激酶活性（PNK）以及抑制剂作用的电化学 传感器。首先将作为T4 PNK底物的 3-HS-DNA通过金-巯键作用自组装到金电极 上，利用修饰有大量二茂铁的单
10、壁碳纳米管产生和放大电化学信号。当ATP存在 时，T4 PNK将电极上底物DNA的 5 端羟基磷酸化，产生的 5 端磷酸基团在Ti4+ 的连接作用下，负载 5-PO4-DNA和二茂铁的单壁碳纳米管沉积到电极表面而产 生强烈的电化学信号，其电流强度与T4 PNK活性成正比，可检测到 0.01 UmL-1 的T4 PNK。 该方法为研究蛋白质和核酸之间的相互作用及激酶活性测定提供了一 个通用性平台。 四、四、半支莲提取液生物合成金纳米颗粒及其在电化学上的初步应用半支莲提取液生物合成金纳米颗粒及其在电化学上的初步应用 采用半支莲提取液作为还原剂细胞外合成了金纳米颗粒，并实现在电化学上 的初步应用。首
11、先将金离子置于半支莲提取液溶液中，可以观察到金离子迅速被 还原， 在溶液中形成金纳米颗粒， 通过紫外-可见吸收光谱表征合成的金纳米颗粒， 发现在 540 nm 处有明显的特征峰。透射电子显微镜（TEM）分析表明，合成的 颗粒分散性良好，大小在 5-30 nm。在此基础上，将合成的金纳米颗粒用于修饰 玻碳电极，结果表明以半支莲提取液作为还原剂合成的金纳米颗粒能够很好的提 高对硝基酚和电极之间的电子传递速率。 五、五、基于基于 MCM-41 负载联吡啶钌的电致化学发光传感器研究负载联吡啶钌的电致化学发光传感器研究 利用静电吸附作用将联吡啶钌Ru(bpy)3 2+负载到制备好的巯基化MCM-41 型
12、介孔二氧化硅纳米颗粒，通过金巯键修饰方法，将负载有Ru(bpy)3 2+的MCM-41 成功固定在金电极表面，发展了一种基于MCM-41 负载联吡啶钌的电致化学发光 传感器。研究了基于MCM-41 负载Ru(bpy)3 2+的电致化学发光传感器的电化学以 及电致化学发光行为。基于三聚氰胺与增敏剂三正丙胺的氨基结构类似性，将 MCM-41 负载Ru(bpy)3 2+的电致化学发光传感器初步应用于三聚氰胺的检测，获 得了良好的检测效果，为三聚氰胺的检测提供了一种快速、简便的方法。同时， 该研究为Ru(bpy)3 2+在电极表面的固定化提供了新的思路。 六、六、基于类分子信标基于类分子信标 DNA
13、和连接酶高灵敏电化学检测和连接酶高灵敏电化学检测 ATP 结合连接酶和类分子信标DNA发展了一种高灵敏电化学检测ATP的方法。该 方法在没有ATP的情况下，固定在电极表面的类分子信标DNA上 5 端的生物素 靠近电极表面，阻碍了溶液中电子的有效传递。当加入ATP之后，连接酶被激活， 类分子信标DNA的茎环结构被打开，阻塞物远离电极表面，形成离子通道，电化 学信号明显的增大。在最优实验条件下，ATP的线性检测范围为 0.11000 nM， 基于纳米材料信号放大电化学传感器的设计与研究 IV 最低检测限为 0.05 nM，而且该方法还具有很好的选择性，能够很好的区分ATP 类似物UTP，CTP和G
14、TP。除此之外，该方法也可以用于水样中大肠杆菌的检测， 检测的响应范围为 103 -107 cfu/mL。 关键词：电化学传感；核酸适体；纳米材料；纳米胶囊；介孔纳米颗粒；碳纳米 管;金纳米颗粒 博士学位论文 V Abstract Electrochemical biosensors have widely attracted the interests of researchers due to the advantages of high sensitivity, simple operation, avoid separation, good selectivity, and no ne
15、ed of sample preparation. The current applications for its research and development is very fast, which has been applied to industrial processes control, clinical testing, environmental monitoring, chemical safety assessment food, pharmaceutical and other areas. In addition, the nanomaterial is wide
16、ly used in electrochemical sensing technology because of its excellent chemical and physical properties, high surface area, the sensitivity of molecular adsorption capacity, and the capacity of improving the speed of biochemical reactions. In this paper, we carried out the research work focused on the electrochemical biosensors studying using nanomaterial as signal amplification, the main work are listed as follows: 1. Electrochemical d
