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1、卫生指示微生物检测,主要内容,第一部分 菌落总数测定 第二部分 霉菌，酵母菌计数 第三部分 大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌计数,菌落总数测定,食品微生物学检验 菌落总数的测定 (GB 4789.22010),原理,细菌数量的表示方法由于所采用的计数方法不同而有两种：菌落总数和细菌总数。,1、菌落总数 是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中形成的细菌菌落总数。以 CFU/g（mL）来表示。 一定条件包括培养基成分、培养温度和时间、pH、是否需要氧气等。,按国家标准方法规定，即在需氧情况下， 36 1培养482 h，能在平板计数琼脂上生长发育的细菌菌落总数。所以厌氧或微需
2、氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。,菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。,菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。,食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。,2、细菌总数 指一定数量或面积的
3、食品样品经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1 g或1 mL样品中的细菌总数来表示。,三 、 材料,1、 食品检样 2、 培养基 平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 3、 其它 无菌培养皿，无菌吸管（1ml，10ml），量筒，烧杯，酒精灯，天平，电炉，恒温培养箱等。,菌落总数测定,四、 流程,1、检样 2、做几个适当倍数的稀释液 3、选择23个适宜稀释度各1 mL,分别加入灭菌平皿内 4、平皿内倾注1520 mL琼脂培养基，混匀 5、36 1培养482小时或（242）小时 6、记录稀释倍数和相应的各平
4、板菌落数量 7、 计算菌落总数 报告,(一) 取样、稀释和培养 1、 以无菌操作取检样25g于225ml无菌水一起进入无菌均质杯内800010000r/min均质12min， 制成1：10的均匀稀释液。 2、用1 mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，振摇试管或反复吹打混合均匀，制成 1：100的稀释液 3 、另取1 mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1 mL吸管。,4、根据标准要求或对污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀
5、释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。 同时分别取1ml稀释液（不含样品）加入两个灭菌平皿内作空白对照。 5 、稀释液移入平皿后，将冷却至46琼脂培养基注入平皿约1520ml，并转动平皿，混合均匀。 6、 待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养482h,微 生 物 检 验 流 程 图,无菌取样,样品均质,样品的处理和稀释,倒平板,熔化已灭菌的培养基并冷却至45左右倒平板，每种培养基每个稀释度各二只平板。,（二） 菌落计数 做平板菌落数记录时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。 到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计
6、数，应将平板放置于04，但不要超过24h。 1、 平皿菌落数的选择 选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿，大于300的可记为多不可计。,2、其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平板后乘以2，以代表一个平板的菌落数。,3、当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。,（三）菌落总数的计算 1、若只有
7、一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。,2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按如下公式计算： N=C/（n1+0.1n2）d（1 ) 式中： N 样品中菌落数； C 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； nl 第一个适宜稀释度平板数； n2 第二个适宜稀释度平板数； d 稀释因子（第一稀释度）。,例如： 稀释度 1:100（第一稀释度） 1:1000（第二稀释度） 菌落数 232，244 33，35 232+244+33+35 (2+0.12) 10-2 =544/0.022=2
8、4727 四舍五入表示为: 2.5 104,3、 若所有稀释度的平板菌落数均300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算。,4、若所有稀释度平板菌落数均30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数计算。 5、若所有稀释度平板均无菌落生长，则应按1乘以最低稀释倍数计算。,6、若所有稀释度均不在30300之间，有的300，有的又30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。,实验结果图片展示 10-1 10-2,10-3 10-4,（四） 菌落计数报告方法,1、菌落数在1100时，按四舍五入报告两位有效数字。 2、菌落数 100时，第三位数字按四舍五入计算，取前面两位有效数字，为
9、了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。,3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 4、 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 5、称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。,注意事项,1、无菌操作 操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。,2、采样的代表性 如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。,3、
10、稀释液 样品稀释液主要是灭菌生理盐水，或磷酸盐缓冲液（或0.1蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。,4、每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。 5、倾注用培养基应在46水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。,6、倾注培养基的量规定不一，从1220ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。,7、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽
11、快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。,8、培养温度一般为37（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15。,9、为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4环境中放置，以便计数时作对照观察。,六、 结果,1、 将实验测出的样品数据以表格的方式报告。 2 、对样品菌落总数作出是否符合卫生
12、要求的结论。,报告方式,菌落总数测定几点说明,由于检样中采用30/35有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。 鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colony forming units，CFU）报告。,菌落总数测定几点要求,每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min，主要为防止细菌增殖和产生片状菌落
13、。样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。 检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。,菌落总数测定几点要求,检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4 放置，以便在计数检样时用作对照。,七、思考,1、 什么是细菌菌落总数（cfu）？ 2、 影响杂菌总数准确性的因素有哪些？ 3、
14、在食品卫生检验中，为什么要以细菌菌落总数为指标？ 4、为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在461的温度？,霉菌酵母菌计数(GB4789.15-2010),霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成中腐败变质。有些霉菌能够合成有毒代谢产物霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等 。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染
15、的程度。,霉菌酵母菌菌落形态,霉菌菌落形态：菌落呈绒毛状，絮状，蜘蛛网状。成熟的霉菌菌落多数有各种颜色的孢子形成，随种而异。 酵母菌菌落形态：在孟加拉红琼脂平板上，多数为圆形凸起，边缘整齐，表面光滑湿润，呈不透明乳脂状，乳白色或粉红色。少数表面粗糙或皱褶，有的菌落周边呈细分枝状。位于琼脂内的菌落，可呈铁饼形、三角形及多角形。菌落外观与细菌菌落不易区别时，应挑取菌落，用水制片，置高倍显微镜下观察，其细胞个体比细菌大数倍，多为圆形或卵圆形，绝大多数为出芽繁殖。当平板内酵母菌菌落甚多时，常有酒香气,孟加拉红（虎红)培养基上 的霉菌和酵母,实验流程,稀释：1、以无菌操作称取检样25g(或25mL)，放
16、人含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。 2、用灭菌吸管吸取110稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。 3、取1mL110稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1100稀释液。 培养：倒置于2528温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。 计数：选取菌落数10150之间的平板进行计数。（稀释度选择和菌落报告方式参考菌落总数的测定,1.实验数据记录如下,实验结果图片展示,10-1,10-2,。,10-3,10-4,10-5,2.结果处理,在10-110-5这五个稀释度中，10-1的生长状况较其它稀释度好，所以选取10-1进行计数.,大肠菌群、粪大肠菌群和
