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1、2019/11/10,国内外食品微生物检测方法,山东检验检疫局技术中心 雷质文,2019/11/10,微生物检验标准方法的必要性和重要性,有法可依 有法必依 执法必严 违法必究,有法可依 有章可循 有据可查 有错必纠 有洞必补,对食品中的致病微生物进行监测是国家意志的体现,2019/11/10,准确、可靠的检验结果是正确评价和保证食品安全性的先决条件，也是国际贸易上公平交易的有力科学依据。在食品微生物检验领域中，检验规程规范化和分析方法标准化是检验结果可信性的重要保证。,避免“公说公有理，婆说婆有理”；避免“仁者见仁，智者见智”,2019/11/10,内 容,第一部分 国内外食品微生物标准检验
2、体系 第二部分 微生物检验快速检测系统 第三部分 方法的选择 第四部分 微生物检验方法的编写 第五部分 食品微生物检验方法的验证和确认,2019/11/10,第一部分 国内外的食品微生物标准检验体系,一、术语和定义 1、标准方法：指国际、区域、国家发布的经过严格确认的以及公认的方法。标准方法包括参考方法和公定方法。 （1）参考方法：指适用于特殊待验目标的经过国际或国家公认的检验方法。对于食品微生物检验而言，典型的传统的参考方法是培养法。 （2）公定方法：指知名的技术组织或机构（如AOAC）公布的检测方法。 2、非标准方法：标准方法中未包含的需要确认后才能采用的方法。,可替代方法：指用来检验某一
3、特定产品中某种目标微生物的与相应参考方法等效的方法（ISO 16140:2003），如快速检测试剂盒和自动化系统。值得说明的是，并非所有的可替代方法都是标准方法。,2019/11/10,二、国内外食品微生物检测体系,2019/11/10, 食品中常规指示菌和致病菌的关系,2019/11/10,常规指示菌和致病菌的“危害分类”,2019/11/10,食品微生物检测方法,2019/11/10,2019/11/10,2019/11/10,2019/11/10,MPN法适用于污染程度低，含有受到损伤的加工食品，目标微生物数量低，否则，应用直接计数方法,间接计数法最大可能数量（MPN）,2019/11/
4、10,三、区分几个关系,1、国家标准与行业标准的关系？ 食品微生物检验的国家标准是GB/T 4789，其为基础标准，行业标准方法原则上应与其一致，至少不能与国家标准相矛盾。进口产品用GB?出口产品用SN? 2、国家标准与国际标准的关系？ 为了公平贸易，国家标准应与国际标准接轨。应考虑优先使用国际标准。 现状。实例：2004年USDA来青进行等效性评估。 3、 国内国家标准/行业标准与他国国家标准/行业标准的使用？ 根据ISO/IEC 17025的规定，如果进口国要求使用他国国家标准/行业标准，原则上要满足客户的要求，否则，需与客户协商。即使国内国家标准/行业标准与他国国家标准/行业标准等效或等
5、同，也必须与客户协商和沟通，只有做客户统一的情况下方可使用。,2019/11/10,第二部分 微生物快速检测系统,2019/11/10,第一节 主要微生物检验快速检测系统,一、以免疫学为基础的检验法,2019/11/10,免疫磁珠检验法的优点: 特异性好 灵敏度高 1CFU 所捕获的菌是活菌 快速、操作步骤简便 可快速处理较大量样品,2019/11/10,2019/11/10,2019/11/10,2019/11/10,二、以分子生物学为基础的检验法,2019/11/10,PCR技术将是众多食品微生物快速检测中被认可的一枝独秀的快速检测技术之一。 但须注意：如何减少培养基成分的干扰？死菌的干扰
6、和风险？等等,2019/11/10,2019/11/10,三、生化鉴定系统,2019/11/10,2019/11/10,四、根据酶触反应及代谢产物快速检测细菌,2019/11/10,2019/11/10,2019/11/10,五、其他部分自动化系统,2019/11/10,BIOLOG自动微生物鉴定系统,BIOLOG,OmniLog & OmniLog Plus,MicroLog 1,MicroLog 2,MicroLog 3(MicroStation),OmniLog,MicroLog,2019/11/10,第二节 微生物快速检测系统的局限性,大部分快速方法适用于检测单一微生物，适用于质量控制
7、程序中快速筛选大量食品样品中所存在的特殊病原体或毒素。然而，快速检验方法所得阳性者，仅仅是可疑，必须用标准参考方法予以证实，虽然证实试验需要几天，但不能予以限制。,快速检验方法的评估结果表明，其对于某类食品的性能优于其它食品，很大程度上是由于食品成分干扰所致，有些食品成分对于快速方法中所应用的技术是比较麻烦的。例如，每一食品成分可能抑制DNA杂交或Taq聚合酶，但对抗原-抗体相互作用没有影响，反之亦然。既然方法的灵敏度、特异性和精确性依赖于待验食品，那么进行比较研究以确保某一特殊检验方法能有效分析此类食品是明智的。,2019/11/10,基于DNA检验方法的特异性通过短的探针来显示，因此用特殊
8、探针或引物检测毒素基因，阳性结果仅仅表明某细菌具有该基因序列，以及某细菌可能是产毒的，不能从客观上说明该基因得以表达，并产生毒素，例如在梭菌和葡萄球菌中毒病例中，DNA杂交和PCR仅能检测到基因的存在，但不能用来检测预先形成的毒素是否存在。 随着某一快速方法更加频繁的使用，其好处和局限性同时变得更加明显。使用者在选择和彻底评估这些快速方法时，必须保持谨慎。,2019/11/10,FDA认可使用的检测系统和试剂盒, 检测和鉴定食源性病原菌的微量生 化复合试剂盒 微生物自动鉴定系统 核酸杂交分析（分子生物学）方法 免疫学分析方法 其它商品化快速检测方法和培养基,第三节 微生物快速检测系统的认可,一
9、、USDA FDA 认可情况,2019/11/10,2019/11/10,2019/11/10,2019/11/10,2019/11/10,2019/11/10,2019/11/10,二、AOAC、NMKL、AFNOR、 NORDVAL、MICROVAL的认可情况,2019/11/10,第三部分 方法的选择,1客户要求； 2方法的准确性； 3方法的特异性； 4方法的实用性； 5方法的稳定性； 6方法的灵敏度； 7方法的检测限和测量限； 8实验室硬件条件（仪器、设备、场地设施、人员资质等）； 9商业快速检测系统的供应保证、价格、认可程度和售后服务。,2019/11/10,通常情况下，实验室应采用
10、满足客户（注：对于企业实验室，其所在单位为其内部客户）需要并适用于所进行的检测的方法，包括在抽样的方法。应优先使用以国际、区域或国家标准发布的方法。当认为客户提出的方法不合适或已过期时，实验室应通知客户。,当客户未指定所用方法时，除优先使用国际、区域、国家或知名的技术组织发布的标准方法外，还可选择非标准方法，但必须对所选择的非标准方法进行严格验证、确认和审批，如能满足实验室的预期用途，并经客户同意，也可使用。,2019/11/10,第四部分 微生物检验方法的编写,标准方法的一般构成和编写顺序： 1资料性技术要素：封面、目次*、前言、引言； 2规范性一般要素：名称、范围、规范性引用文件*； 3规
11、范性技术要素：术语和定义*、符号和缩略语、食品微生物检验(原理*、培养基和试剂、设备和材料、采样*、制样、增菌培养、筛选、鉴定和确认等)、结果判定（判定方法和判定标准）、结果报告*、规范性附录*； 4资料性补充要素：资料性附录*、参考文献*、索引*。 上述构成要素不是任何一项标准都需要全部包括的，标有*者可根据标准化对象的特征和制定标准化的目的而取舍。,第一节 标准方法的编写,2019/11/10,2019/11/10,2019/11/10,第二节 非标准方法的编写,一般要求以接近国家标准（如GB/T 1.12000）或行业标准推荐方法的格式进行编写。等同、修改采用国际标准或国外先进标准时，其
12、编写格式和方法可与被采用的标准一致。 力求标准结构严谨、层次分明 、主题突出，简单易懂。,一、非标准方法的编写原则,2019/11/10,二、非标准食品微生物学检验方法的基本编写格式,（1）封面 每项非标准微生物检验方法应该有封面，封面的内容有“（单位）（部门）非标准方法”字样和非标准方法的标志（注：选择性的）、中文名称、英文名称（注：选择性的）、非标准方法的唯一性编号、代替非标准编号（注：选择性的）、发布日期、实施日期、标准的审批部门等（见附录1示例2）。 （2）正文内容 一般包含下列内容，必要时可增减相关条目： 目的、范围； 方法提要或原理:简述所用方法的主要步骤及采用的基本原理； 设备和
13、材料：标明规格和型号； 培养基和试剂：必须符合GB/T 4789.28和SN/T 1583的规定； 检验程序：画出主要的检验程序框图； 操作步骤：包括试样制备（含稀释或按特定条件的制备）、培养（含前增菌培养和增菌培养，分离培养等，可根据需要取舍和分步描述）、初步鉴定（可根据需要取舍）、确证鉴定（含进一步的生化反应和血清学分型，可根据需要确定试验内容）毒素试验（可根据需要取舍）、动物试验（可根据需要取舍）； 结果报告； 其它（包括内部质量保证要点、生物防护要求；）； 附录（资料性附录和规范性附录） 方法来源（如参考文献、仪器设备方法等）。,2019/11/10,三、非标准方法的审批,2019/1
14、1/10,第三节 标准操作程序的编写,标准操作程序（standard operation practices，SOP）是用来指导某个具体过程、事物所形成的技术性细节描述的可操作性文件，国内常常称之为“作业指导书”，二者没有本质区别。 SOPs的编写及使用是实验室成功质量体系中的一部分，因为它能为操作人员提供正确完成一项工作的信息，从而保证不同操作人员都能在一定的不确定度范围内得到相同的微生物检验结果。实验室应关注以下四个方面SOPs： 1方法类：包括食品微生物检验方法中不详细或不完善部分的补充，期间核查、方法确认及比对等； 2设备类：重要或复杂设备的使用、操作规范（如设备制造商提供的技术说明书
15、不够明细等）； 3样品类：取样、制样和样品处置的“实施细则”等； 4数据类：定量检测结果的表达、异常数据的剔除、测量结果不确定度的评定等等。 SOP是技术性的文件，并不要求必须制订。,一、定义和分类,2019/11/10,二、食品微生物检验SOP的编写依据,目前，在国内，尚未检索到关于食品微生物检验SOP的编写导则及相关要求；在国外，美国环境保护署(EPA)(http:/www.epa.gov/quality/sops.html)和美国农业部销售司(AMS)( http:/www.ams.usda.gov/science/mpo/)均发布关于微生物检验SOP的编写导则及相关要求，前者是后者的蓝
16、本： EPA QA/G-6 Guidance for Preparing Standard Operating Procedures (SOPs)； EPA SOP ADM-02-02Standard Operating Procedure for Preparation and Review of Standard Operating Procedures (SOPs)； USDA MDP-ADMIN-07Preparation and Maintenance of Standard Operating Procedures (SOPs)。 以上文本均可从相应网站免费下载，同时EPA和USDA AMS制定了一系列与微生物检验相关的SOPs，这些SOPs的编写结构和格式值得借鉴和参考。,2019/
