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1、研究生学科知识讲座,色谱技术发展及应用,湖北大学 化学化工学院,Development and Application of chromatography,E-mail: hxch Tel: 13377889849; 15337244620,陈怀侠 教授,主要内容,色谱法的发展 质谱法的发展 气相色谱法及气质联用 液相色谱法及液质联用,化学学科,现代分离方法,电化学分析,光谱分析,CE,LC,GC,知识内容立足点,经典色谱法 Chromatography,1905年俄国植物学家M.G. 茨维特,柱色谱 纸色谱 薄层色谱,一、色谱法的发展,Michael Tswett(1872-1919), a
2、 Russian botanist , discovered the basic principles of column chromatography. He separated plant pigments by eluting a mixture of the pigments on a column of calcium carbonate. The various pigments separated into colored bands; hence the name chromatography.,石油醚,现代色谱法,1952年气相色谱分析法,National Institute
3、 for Medical Research London, United Kingdom,Martin AJP,Rowett Research Institute Bucksburn (Scotland), United Kingdom,Synge RLM,色谱法的发展历史,色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作,色谱法分类,按固定相的形态分类,柱色谱：填充柱、整体柱、毛细管或开管柱 平面色谱：薄层色谱和纸色谱,按色谱动力学过程分类,淋洗色谱法 置换色谱法 迎头色谱法,按两相的物理形态、分离机理等分类,色谱法分类,色谱法特点及与其他分离分析方法比较,分离效率高； 分析速度快； 检测灵敏度高； 样
4、品用量少； 选择性好； 多组分同时分析； 易于自动化； 定性能力较差。,色谱法的优缺点：,色谱法特点及与其他分离分析方法比较,（1）色谱、精馏与萃取：平衡分离方法。 （2）色谱法与精馏、萃取比较：速度快、效率、选择性高。 （3）精馏不能分离沸点相同的组分，萃取不能分离在溶剂中溶解度相同的组分；色谱法可分离沸点、溶解度相同的组分，可分离物理、化学性质相近、其他分离方法不能或难以分离的组分。 （4）色谱法每次处理样品量少。,与精馏、萃取比较,与化学分析比较 （1）不受化学性质限制，是一种分离分析方法。 （2）化学分析本身不具备分离功能。 （3）化学分析一般不适用于分析多组分的混合物。 （4）化学分
5、析定量方法简易；色谱法定量测定较复杂。,与光谱、质谱方法比较 （1）光谱、质谱用于物质定性鉴定，色谱法定性功能差。 （2）色谱法最主要特点是适于多组分复杂混合物分离分析。 （3）色谱仪价格比分子光谱、质谱仪低得多，适用范围广。 （4）色谱检测器比分子光谱法灵敏度更高，比质谱灵敏度低。,现代分离方法两重含义,样品前处理方法：各种提取、分离技术 液液提取LLE、液相微萃取LLME 固相萃取SPE、固相微萃取SPME 微波辅助溶剂提取、加速溶剂提取 超声辅助溶剂提取 现代分离分析方法: 气相色谱GC、高效液相色谱H(U)PLC、 毛细管电泳CE、超临界流体色谱SFC,复杂样品分析思路,获取样品中所有
6、或大多数组分的信息 基因组学、蛋白组学、代谢组学、中药分析等 获取样品中一个或多个组分的信息 环境污染物分析、食品中农药兽药分析、体液中药物分析、材料分析等,举例：Journal of Chromatography B, 881 882 (2012) 34 41,Development and validation of a sensitive solid-phase-extraction (SPE) method using high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LCMS/MS) for determ
7、ination of risedronate concentrations in human plasma,利塞膦酸钠,1918年J.J.Thomson发明了第一台质谱； 1966年Munson和Field提出了CI电离技术； 1981年出现了快原子轰击（FAB）电离技术； 随后出现了各种软电离技术： 如基质辅助激光解吸电离源（MALDI）； 电喷雾电离源（ESI）； 大气压化学电离源（APCI）； 感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）； 富立叶变换质谱仪（FT-ICR MS）； ,二、质谱法的发展,1. 唯一可以确定分子量的方法，特别是现代生物质谱适用于生物大分子分子量（数十万）定； 2.
8、 极高灵敏度，检测限达10-14g；,质谱法特点,按离子源分类,1. 电子轰击源 (electron-impact sources, EI),硬电离,一般有机化合物的电离电位为715eV，被具有电子能量70eV的加速电子轰击后，除了失去或得到一个电子形成分子离子以外，处于激发态的分子离子进一步裂解形成碎片离子和游离基，也可能失去一个中性分子。即70eV能量时，得到丰富的指纹图谱，灵敏度最大。适当降低电离能，可得到较强的分子离子信号，有助于确定分子量。,EI电离：将具有一定能量的电子直接作用于样品分子，使 其电离，且效率高，有助于质谱仪获得高灵敏度 和高分辨率。,EI图谱特征：,灯丝,电子束,试
9、样高温气化,EI离子源,EI源：可变的离子化能量 (1070 eV),电子能量,电子能量,分子离子增加,碎片离子增加,标准质谱图基本都是采用EI源(70eV)获得,EI适用于Mr103的易挥发有机物,EI优点：灵敏度高，适用性强，图谱重现性好， 有标准图谱对照。 缺陷：气化时造成分子热裂解，图谱复杂，分 子离子峰难寻找。,（1）分子离子(Molecular ion),EI源离子类型,分子离子,中性分子,确定分子量和分子式,C6H13Br, Mr = 164, 含硫的样品 32S : 33S : 34S = 100 : 0.8 :4.4,（3）碎片离子(fragment ion),1) 断裂,带
10、有电荷的官能团与相连的碳原子之间的断裂,断裂方式 均裂：XY = X +Y 异裂：XY = X+Y- 半异裂：X+Y = X+ Y,已电离, 含不饱和杂原子,均裂, 烯烃(烯丙断裂), 烷基苯(苄基断裂),2) 断裂,碳原子和碳原子之间的键的断裂,3) 断裂,较易发生,（4）重排离子(rearrangement ion),麦氏(Mclafferty)重排,R1 = H、R、OH、OR、NR2,（5）亚稳离子(metastable ion): m*,离子源内,亚稳离子 （m1速度， m2质量）,离子源后飞行中,特点：强度低、宽、跨几个质量数，m/z非整数，易辨认 用处：证明m1m2裂解过程,2.
11、 化学电离源 (chemical ionization sources, CI),甲烷电离,甲烷离子与分子反应生成加合离子,软电离,反应气体有甲烷、丙烷、氨气、异丁烷等,90%,加合离子与样品分子反应,(M + 17)+,(M + 29)+,CI电离规律：,CI电离与样品化合物类型及反应气体有关： （1）反应气体影响： 甲烷：有M+H+、M-H-、M+C2H5+或M+C3H5+ 异丁烷：有M+H+、M+C4H9+ 氨：有M+H+、M+NH4+ （2）化合物结构影响： 电负性强的元素电子捕获（或再分解）生成负离子：有 M-、M-H-及其分解离子。 CI源会产生一些碎片离子，碎片会进一步离子-分子
12、反应,CI源特点：,解释CI谱时，要综合分析CI谱、EI谱和所用的反应气，推断出准分子离子峰。,优点： 图谱简单，易测得分子量（主要任务），正、负离子模式灵敏度相当。适用于易汽化的样品。 缺点： 不适于难挥发成分的分析，没有标准谱库。,3. 大气压电离 （Atmospheric pressure ionization, API）,API是主要应用于HPLC和质谱联用时的电离方法, 两者都是很软的电离方法，易于得到样品的分子量。有ESI和APCI两种方式。,最软电离,样品从具有雾化气套管的毛细管端流出时在电场和雾化气的吹带作用下喷成无数的带电微液滴，一定温度下，液滴中的溶剂快速蒸发，液滴直径不断
13、变小，表面电荷密度不断增大。最终使溶剂和样品离子从液滴中被排挤出，样品离子进入分析器被检测。,（1）电喷雾电离源(Electrospray Ionizaton， ESI),高电场,强静电场（3-5KV），形成高度荷电雾状小液滴，经过反复的溶剂挥发-液滴裂分后，产生单电荷或多电荷离子。,ESI离子源,ESI特点： 最软电离技术 单电荷或多电荷离子 利于极性强、不稳定的生物大分子的测定,东莨菪碱ESIMS图谱,ESI源离子类型,有机小分子（1000Da以下）： 一级质谱（MS）：单电荷准分子离子，很少碎片 （1）分子离子峰：M+或M- （2）准分子离子峰（加合离子）：和溶液组成有关 M+H+、M-
14、H-、M+Na+、M+K+、M+NH4+ 碱性化合物易生成质子化的分子M+H+； 酸性化合物，易生成去质子化离子M-H-。 （3）聚合离子：2M+H+、2M+Na+、2M-H-、3M+H+ 二级质谱及多级质谱（MS/MS）： 裂解规律同EI相似，但主要丢失为中性分子，很少丢失自 由基。,生物大分子： 一级质谱（MS）为多电荷多离子，计算拟合获得分子量； 二级质谱及多级质谱（MS/MS）产生特征碎片离子。,图1 马心肌红蛋白的ESI质谱图 图2 溶菌酶样品的ESI质谱图,（2）大气压化学电离 (Atomspheric pressure chemistry ionization, APCI),AP
15、CI结构与电喷雾源大致相同，不同之处在于APCI喷咀的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+和O+等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化。 APCI电离机理： 质子转移和电荷交换产生正离子； 质子脱离和电子捕获产生负离子等。,APCI示意图,APCI应用特点： （1）主要用来分析中等、弱极性小分子化合物。 （2）有些分析物由于结构和极性方面的原因，ESI不能产生足够强的离子，可采用APCI方式增加离子产率，APCI是ESI的补充。 （3）与CI不同，APCI无须加热样品使之汽化，因
16、而应用范围更广。,APCI电离特征： 主要产生的是单电荷离子M+H+或M-H-，分析的化合物分子量一般小于1000 Da，很少有碎片离子，主要是准分子离子。,银杏叶中聚戊烯醇化合物APCI-MS,M - CH2OH,4. 基质辅助激光解析质谱 （Matrix-assisted Laser Desorption Ionization，MALDI）,用小分子有机物作基质，将样品溶液和基质混合均匀，干燥成为晶体或半晶体后送入离子源内。用一定波长的脉冲式激光照射，基质分子能有效地吸收激光能量，瞬间由固态转化为气态，基质离子与样品相互碰撞使样品离子化，而得以进行质谱分析。,MALDI示意图,常用基质： 2,5-二羟基苯甲酸、芥子酸、烟酸、2-氰基4-羟基肉桂酸等,MALDI特点： 准分
