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1、海洋浮游生物粒径谱分析技术 吴成业 3 33 焦念志 3 ( 3 厦门大学环境科学研究中心近海海洋环境科学国家重点实验室 厦门 361005)( 33 集美大学水产学院 厦门 361021)摘 要 提出了一种基于浮游生物粒径组成和数量分布关系的生物粒径谱研究方法。这一方法可最大限度地将粒径分组 ,形成近乎连续的谱图 ,并利用自然海水样品验证了该技术在浮游生物粒径结构研究中的应用效果 ,表明该技术对于海洋生态群落结构研究和环境监测等具有广阔的应用前景。关键词 浮游生物 , 粒径谱 , 群落结构0 引 言海洋浮游生物粒径结构是海洋生态群落结构的一个重要方面 ,是具有重要生态学意义和应用价值的指标。
2、海洋生态系统中的能流分配 , 在很大程度上取决于生物颗粒的大小。生物粒径谱又称生物颗粒谱 ,是指浮游生物的数量或生物量与生物颗粒大小之间的对应关系 ,即生物在不同粒径的分布状况。1972 年 ,Sheldon 等首次测定了海洋浮游生物的粒径谱 ,得出标准化生物量粒径谱的斜率约为 21 ,即生物量粒径谱的斜率为 01 。 Sprules 等的研究也得到类似的结论 2 ,3 。但是后来的研究表明 ,随着浮游生物粒径的增大 ,其生物量粒径谱的斜率趋向于正值 4 。这些研究表明 ,对于所有浮游生物来说 ,其整体粒径谱是比较稳定的。而对于生态功能相近的某些特定组分 ,如浮游植物 ,其粒径谱更容易受环境因
3、素影响而发生变化 5 。不同的生态系统有不同的粒径谱 ,粒径谱在一定程度上可以反映出一个海区的群落组成等生态特征。由于不同粒径大小和形状的细胞具有不同的沉降速率 6 ,生物粒径谱还影响着生态系统中碳的沉降 ,对于碳和其它营养要素的生物地化循环研究来说 ,也有重要意义 7 。因此 ,基于浮游生物粒径组成和数量分布关系的生物粒径谱分析 ,已成为海洋生态学研究的一个新的重要手段。最常用的浮游生物粒径谱研究方法是“叶绿素分级法” ,即通过测量不同粒级的浮游植物所含的叶绿素来描述生物量的在各个粒级的分布情况 7 。这种方法需要萃取叶绿素 ,检测速度慢 ,并且由于分级法的粒径谱只有有限的几个等级 ,这种方
4、法得到的结果较粗略和笼统 ,对问题的阐释程度也是有限的。另一种方法是采用光学显微镜鉴定浮游生物 ,并进行人工计数。此法虽然误差较小 ,但也存在明显的缺点 ,如费时费力 ,不能形成连续的粒径谱 ,也不适用于浮游生物的现场检测。流式细胞仪也是研究浮游植物群落结构的一种重要手段 ,可以测定海水中各种颗粒的散射光和不同波长的荧光。利用荧光 ,它还可以检测以浮游植物为主的含有叶绿素的颗粒。流式细胞法可以快速地检测颗粒的一些光学参数 ,分选出不同的生态类群。但目前一般流式细胞仪的最佳检测范围是 0. 5 20 m ,对于较大的颗粒(如大于 100 m) 反而难以操作。此外 ,由于流式细胞仪结构复杂 ,易受
5、外界干扰 ,很难进行船载现场检测。总之 ,测量浮游生物粒径的方法有很多种 ,但是这些方法之间还没有统一的标准 8 。随着计算机性能的提高和数字化成像技术的发展 ,电子成像系统被用来对海水中的颗粒进行成像和计数。基于浮游生物粒径组成和数量分布关系的生物粒径谱分析技术以数字化成像技术为基础 ,它可以对 3 1000 微米的颗粒进行计数 ,给出简明的浮游生物群落结构图 ,这一技术是研究海洋研究海洋生物粒径谱最富有前景的方法。本文结合海区实际样品 ,对这一新技术进行了研究探讨。17吴成业等 :海洋浮游生物粒径谱分析技术 联系人 ,E2mail :jiao xmu. edu. cn(收稿日期 :2004
6、206228)男 ,1974 年生 ,博士生 ;研究方向 :海洋微型生物生态学。863 计划 (2003AA635160)及科技部重点国际合作项目资助。1 粒径谱分析技术的原理和改进1. 1 原理我们采用流式细胞及显微成像系统 ( FlowCAM ,Fluid2imaging Technologies , Inc. , USA)对不同粒径大小的浮游生物进行计数。 FlowCAM 由流路系统、光学系统和数据采集与处理系统组成 (图 1) 。流路系统包括蠕动泵、进样管、流动室和废液收集器。光学系统包括半导体泵浦激光器、发光二极管 (LED) 、透镜、物镜和滤光片等。数据采集与处理系统包括光电倍增管
7、 ( PMT) 、数码 (CCD) 摄像机和主机。 Flow2CAM 有两种工作模式 ,可以根据样品的特点来选择。图 1 FlowCAM基本工作原理第一种模式是荧光触发模式 ( fluorescencemode) 。激光器发射特定波长的激光 ,照射流动室 ,蠕动泵驱动样品以一定的速度 (约 10 cm/ s)经过“流动室” ,样品色素被激光激发 ,产生细胞色素荧光 (如叶绿素荧光和 / 或藻红蛋白荧光 ) 。利用滤光片将不同波长的荧光分离 ,用光电倍增管检测荧光信号并传输给数据采集系统。后者根据上述荧光信号控制发光二极管闪光 ,照射对应的生物颗粒。同时 ,CCD摄像机通过光路系统将样品的像素特
8、征记录下来 ,并将信号传送到主机 ,再由主机根据细胞的像素特征计算其球形粒径 ( ESD , Equivalent Spherical Diame2ter) 。荧光触发模式要求荧光信号与被激发的细胞一一对应 ,一般仅用于检测浓度小于 100 cell/ ml 的样品。大于这个浓度的样品必需先稀释 ,才能进行检测。第二种方式是自动触发模式 (autotrigger mode) 。与荧光触发模式的主要区别是 ,自动触发模式不是通过荧光信号控制发光二极管 ,而是让发光二极管以一定的频率 (通常每秒 3 次 ) 自动闪光 ,照射经过流动室的细胞。自动触发模式下 ,样品浓度的上限为 1 106 cell
9、/ ml。在两种模式下 ,颗粒的荧光信号、像素特征、球形粒径和其它光学参数都保存在微机系统中 ,以便进行统计分析。为了提高像素分辨率和计数的准确性 ,在光路系统中采用 4X 物镜将颗粒像素放大 ,结合 CCD 摄像机的数字放大功能 ,可将颗粒像素放大50 倍。1. 2 改进在使用过程中 ,我们发现了 FlowCAM 存在的一些问题 ,并提出改进措施 ,涉及本文的主要的改进如下 :1. 2. 1 放大倍数FlowCAM 采用 4X物镜对像素进行放大 ,放大能力较差 ,对于直径小于 5 m 的浮游生物 ,不易获得清晰的象素特征。我们增加了 10X 物镜 ,提高了像素分辨率 ,使 FlowCAM 能
10、对直径大于 3 m 的细胞进行计数。1. 2. 2 流动摄像光源与图像本底信噪比发光二极管照射到流动室上的亮度不均匀 ,产生光斑 ,使 CCD 摄像机所获得的像素特征不清晰 ,影响细胞球形粒径的计算 ,从而影响计数结果的准确性。我们在光路上增加了一个透镜 ,对发光二极管进行聚焦 ,使其亮度均匀 ,提高了信噪比 ,保证了计数结果的准确性。2 样品检测和粒径谱分析2. 1 仪器的校正FlowCAM 利用放大的图像进行计数 ,通过 Flow2CAM的物镜所观察到的视野只是流动室的一部分 ,在不同的放大倍数下 ,视野面积也不一样。此外 ,如上所述 , FlowCAM 两种工作模式的原理也有差异。因此
11、,根据不同的工作方式和放大倍数 ,需要用纯培养的单胞藻或标准荧光小球对计数结果进行校正。以下是采用 10X 物镜和自动触发模式时进行的校正 ,其它放大倍数和工作方式的校正采用类似的方法。取纯 培 养 塔 玛 亚 历 山 大 藻 ( Alexandriumtamarense) 011 ml ,在 10 10 倍显微镜下计数 ,重复 3次 ,求得塔玛亚历山大藻浓度为 216 104 cell/ ml。取上述纯培养藻液 5 ml ,加 45 ml 海水 (0. 2 m27高技术通讯 2005 年 4 月 第 15 卷 第 4 期滤膜过滤 ) 稀释。取稀释后的藻液 10 ml ,用 Flow2CAM的
12、自动触发模式检测 ,重复 2 次 ,计数结果分别为 14. 9 cell/ ml 和 15. 2 cell/ ml ,平均 15. 13 cell/ml。根据显微镜计数和 FlowCAM 检测的结果 ,可以计算样品真实浓度与 FlowCAM 计数结果之间的校正系数 : = (2. 6 104/ 10) / 15. 13 171. 8重复上述实验 ,结果见表 1 ,校正系数 的平均值为 167. 7 13. 4。因此 ,用 10X 物镜和自动触发模式进行检测 ,FlowCAM 计数结果应乘以 167. 7 ,相乘之后的结果才是藻液的实际浓度。2. 2 样品检测样品采自长江口海域 2 个站点 ,位
13、置 : 1 # 站(122. 5E ,31. 0N) ,2 # 站 (123. 5E ,30. 0N) 。 1 # 站靠近长江口 ,盐度和温度均低于 2 # 站。用 Goflo 采水器采表层海水 100 ml ,加入 1 ml 甲醛固定 ,避光保存。采样时间 :2003 年 3 月。取海水样品 10 ml ,用 10X物镜和用自动触发模式检测 ,样品流速为 1 ml/ min。重复 3 次求平均值。每测一个样品后用 10 ml 过滤海水清洗进样管。表 1 Flowcam 校正系数原藻液浓度 (个 / 毫升 ) 稀释倍数 flowcam计数 (个 / 毫升 ) 校正系数 平均值3290000 5
14、0 338. 5 194. 4640000 30 130. 4 163. 8640000 10 398. 0 160. 8640000 60 69. 3 154. 1 167. 7 13. 426000 10 15. 13 171. 813865 1 82. 2 168. 76354 1 41. 6 152. 75354 1 30. 5 175. 52. 3 标准化浓度粒径谱海水中浮游植物的粒径谱可以用下式来表示 5 :F = aWb (1)其中 , F 是细胞浓度、生物量或标准化生物量 , W 是细胞大小的测量值 (可用细胞的体积或球形粒径ESD 来表示 ) , a 和 b 均为常数。在实际
15、应用中 ,通常对等式两边取对数以获得直线方程 ,称为标准化浓度粒径谱 ,即 :lg F = lg a + b lg W (2)其中 ,lg a 为 Y 轴截距 ,可反映水体中的细胞总数或总生物量。当斜率相同时 , Y 轴截距越大 ,则粒径谱直线与两个坐标轴所围成的面积越大 ,水体中细胞数量或生物量也越大 ; b 为斜率 ,可反映生物量在不同大小的细胞之间的分布情况 ,斜率越小 ,则小细胞的所占的比例越大。根据检测结果求对数并作图 ,得到浮游植物标准化浓度粒径谱 (图 2) 。从图 2 可知 ,1 # 、 2 # 样品粒径谱的斜率分别为 - 014012 和 - 21833 ,1 # 样品的斜率
16、小于 2 # 样品 ,表明 1 # 样品中小细胞所占比例大于 2 # 样品。 1 # 、 2 # 样品的 Y 轴截距分别为610766 和 414807 ,1 # 样品的 Y 轴截距大于 2 # 样品 ,而且图中 1 # 样品的谱线位于 2 # 样品谱线上方 ,它与两坐标轴之间的面积大于后者 ,表明 1 # 样品的细胞总数大于 2 # 样品。实测的结果是 :两个样品中 ,大于 3 m 的细胞数量分别为 1123 105cell/ ml 和 816 103 cell/ ml ,与上述分析结果吻合 ,初步验证了粒径谱分析技术的实用性。上述结果表明 ,粒径谱分析结果可以反映不同粒径的细胞之间的数量关系 ,揭示海洋生物的粒径结构。图 2 标准化浓度粒径谱37吴成业等 :海洋浮游生物粒径谱分析技术3 结 语这种基于浮游生物粒径组成和数量分布关系的生物粒
