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1、医学病毒的培养与储存关键词:病毒 细胞 细菌 化学试剂 标准物质中心 北京标准物质网对于病毒学家来说,要想研究病毒,首先要学会培养病毒。人们已经发明了各种各样的方法培养病毒,有些方法是在无细胞系统下培养病毒,但是大部分情况下都是在病毒允许细胞中培养病毒。用细菌来培养噬菌体,特定的植物或者去除细胞壁的植物细胞培养植物病毒,而培养动物病毒可以用生物体,例如鼠、含有鸡胚胎的鸡蛋或者昆虫幼虫。根据接种的宿主不同,接种方法可以分为以下三种。1.动物接种 是最原始的病毒培养方法。常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴等,接种的途径有鼻内、皮下、静脉、脑内等。根据病毒种类不同,可以选择不同的敏感动物及适宜接种
2、部位。2.鸡胚培养 是最常用的方法之一,鸡胚组织分化程度低,细胞幼嫩,有利于病毒的生长。接种鸡胚对多种病毒敏感,根据病毒种类不同,可将标本接种于鸡胚的羊膜腔、卵黄囊、屎囊腔或者绒毛尿囊膜上。3.组织培养 将离体活组织块或分散的活细胞加以培养。组织培养法有三种基本类型:器官培养、移植培养和细胞培养。细胞培养最常用于培养病毒,根据细胞的来源、染色体特性及传代次数可以分为下列四种类型:原代细胞培养、次代细胞培养、二倍体细胞系和传代细胞系。大部分病毒很容易被冻存在细胞培养基中。病毒是一种无细胞结构的生命体,个体小、结构简单并且不含水,因此比其他微生物更稳定。病毒的感染力在低于-60会保存得很好,如果温
3、度逐渐升高(超过),其感染力会显著下降。一般而言,小病毒比大病毒稳定;DNA 病毒比 RNA 病毒稳定;在室温条件下,无包膜病毒比有包膜病毒稳定,这种差别在低温或者极低温度下不明显。一般不推荐将病毒悬液储存在-20。但是如果对病毒感染力没有要求,储存的样品只用于临床诊断(例如利用 ELISA 检测病毒抗原),可以将样品储存在-20,在这个温度下病毒的抗原活性不变。在液氮中储存的病毒库,如果没有保存在热收缩管中,可能会造成交叉污染。蛋白质对于病毒保存来说是一种有效的保护剂,一般来说,使用的悬浮培养基为包含 10或者更高含量血清或者其他蛋白的组织培养基。尽管蛋白保护的具体机制现在还不太清楚,但是在
4、病毒冻存期间其对 pH 变化(病毒储存的最佳 pH 在 70 到 8. 0 之间)的缓冲能力都有利于病毒感染力的保存,并且能够帮助病毒颗粒储存在胶体分散体中,减少或者抑制有损核酸的反应。储存不稳定的病毒时,可以利用特殊的蛋白保护剂,包含 1的牛血清蛋白的蔗糖-磷酸-谷氨酸溶液或者高渗透性的蔗糖溶液,例如呼吸道合胞病毒。一般来说,推荐使用高滴度的病毒悬液,并且小体积(0. 105ml)快速冷冻储存。在使用病毒之前,应将冻存的病毒小管迅速放到 37水浴锅里解冻。包含病毒病原物的样本可以保存在-70或者-80几年时间,而病理学特性不会改变。在组织或者血液来源的样本中,病毒可以储存在极低温度下,而不用特殊处理。储存在加有 10FBS 和 10DMSO 的 RPMI 1640 的外周血淋巴细胞一般用来分离 HIV。另外,一定要注意多次冻融血清样本对核酸稳定性的影响。