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1、流式细胞仪的原理与应用 The principles and applications of Flow Cytometry,焦 鹏,2,流式细胞术(flow cytometry, FCM)是20世纪70年代发展起来的一种以流式细胞仪为工具，能快速测量细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等，并可对其分类、收集的高新技术。,概述,3,流式细胞术（FCM）借鉴了荧光显微镜技术, 同时利用计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术的发展, 将荧光显微镜的激发光源改为激光, 使之具有更好的单色性与激发效率, 因而大大提高了检测灵敏度, 同
2、时将固定的标本台改为流动的单细胞悬液, 用计算机进行数据处理, 从而大大提高了检测速度与统计精确性, 而且从同一个细胞中可以同时测得多项参数, 被誉为是细胞分析领域的“CT”。,4,流式细胞术（FCM）以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。,流式细胞术 是一种能快速测量细胞的物理或化学性质的高技术。利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。与传统荧光镜检查相比，具有速度快
3、、精度高、准确性好等优点， 成为当代最先进的细胞定量分析技术。,6,国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产: BECKMAN- COULTER公司 Becton-Dickinson公司(简称B-D公司) 流式细胞仪主要有两型: 临床型（又称小型机、台式机） 综合型（又称大型机、分析型） 除具备检测分析功能外 , 还具有高速细胞分选功能 , 多用于科学研究。,流式细胞仪的原理与应用,一 流式细胞仪的原理 二 流式细胞仪在生物医学中的应用,8,流式细胞仪（Flow Cytometer) 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量
4、 1973年世界第一台商用流式细胞仪FACS I（Fluorescence Activated Cell Sorter） 1980年中国第一台流式细胞仪FACS II北师大 生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、临床检验等领域,9,流式细胞仪的工作原理 待测样品制成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料对细胞（或表面抗原等）染色后放入上样管中，在清洁气体的压力下将待测样品压入流动室，与此同时，不含细胞的磷酸盐缓冲液（鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 流
5、式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照 在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。,10,前向角散射，即FSC，与细胞直径成正相关，所以我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。 侧向角散射，即SSC，是指与激光束正交90度方向的散射信号，它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内结构及颗粒性质的信息 这两种信号同时被前向光电二极管和90方向的光电倍增管接收。前向光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小。 荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多
6、个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度。,11,流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。,12,13,鞘液的作用有二：一是约束样品使之在喷嘴中心以提高测量精度； 二是防止样品靠近喷孔壁以避免堵塞喷孔。在这种约束作用下，细胞排成单列一个跟随一个地在鞘液包裹下由流动室下面的喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱
7、与入射的高度聚焦的激光束相交，此时，细胞上的荧光染料被激发而产生特异性荧光。在与入射激光和液柱都垂直的方向设置有荧光测量系统，包括透镜、光阑、滤片、检测器等，将细胞的荧光信号变成电信号输出到计算机，用专用软件进行分析。,14,液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱,15,另外，通过选择不同的单克隆抗体及荧光染料，我们可以利用FCM同时测定一个细胞上的多种不同特征； 如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还可以利用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究。,16,应用范围,凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细胞仪检测。 前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发 在生物检测技术中
8、流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。,17,流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种在功能水平上对单细胞 或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，可以每秒钟分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。其应用范围非常广泛，而且还在不断增加。当然，细胞分选也是它的重要应用之一。它能够根据每个细胞的光散射和荧光特征，将特定的细胞从细胞群体中分选出来。每次一个细胞。所以人们又常常将流式细胞仪称为荧光激活细胞分选仪（fluorescence-activated cell sorter, FACS）,18,流式细胞仪特点,单细胞悬液或生物颗粒,分析速度快,多参数,精度高,当代最先进的细
9、胞定量分析技术,细胞群体的均值和分布情况,分选感兴趣的细胞,19,流式细胞仪的检测范围,细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量,细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体,20,1流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测3000 6000个细胞, 大型机可达每秒几万个细胞。 2流式细胞仪的荧光检测灵敏度： 一般能测出单个细胞上600个荧光分子, 两个细胞间的荧光差5%即可区分。 3前向角散射光（FSC）检测灵敏度： 前向角散射光（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能
10、够测量到0.2m.5m。,流式细胞仪主要技术指标,21,4流式细胞仪的分辨率： 这里的分辨率与其它地方的解释差异太大。通常，“分辨率”被表示每一个 方向上的像素数量，分辨率越高图像越清晰。 这里的分辨率是衡量FCM仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV来表 示。如果一群含量完全相同的样本，用流式细胞仪测量，CV值越小则曲线分 布越窄越集中，测量误差就越小，分辨率越高。一般的FCM在最佳状态时 CV2%。 这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5流式细胞仪的分选指标： 分选指标主要包括：分选速度、分选纯度和分选收获率。 分选速度指FCM每秒从液体中提取所要细胞的个数。 分选纯度指
11、被分选出细胞中目标细胞所占的百分率。 分选收获率指被分选出细胞占原来溶液中该细胞的百分率。,2 流式细胞仪的基本结构,光学系统 液流系统 电子系统 数据处理系统 分选系统,19,23,经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。 光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。 为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。 带阻或
12、带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC（Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）发射的525nm绿光通过。长(短）波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上（下）的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。,流式细胞仪的光学系统,24,FACSCalibur流式细胞仪的光路图,25,我中心检测型流式细胞仪：BD FACSCalibur 激光：488nm,633nm 常用荧光标记： FL1：GFP;CF
13、SE;FITC;Alexa Flouro 488 FL2：PE;PI FL3：7-AAD;PE-Cy5;PerCP;PerCP-Cy5.5;PE-Cy5.5;PE-Cy7 FL4：APC; Alexa Flouro 647 一般检测项目： 细胞凋亡检测 细胞周期检测 细胞内活性氧检测 细胞表面标记检测 细胞内因子检测,26,激光 (Laser) 荧光素与荧光 FACS检测的信号参数,27,激光-,激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照 单色性好，方向性好，亮度高，可提高分辨力 激光波长: 488nm, 635nm,细胞微弱荧光快速分析的理想光源,28,F
14、ACSCalibur的激光系统,经常使用的荧光素,FITC Fluorescein isothiocyanate PE Phycoerythrin PerCP Peridinin chorophyll protein APC Allophycocyanin PI Propidium iodide,PerCP（470-670）,PE（488-575）,APC （635-660）,Texas Red （488-525）,PE-CY5.5（488-667）,PI （536-617）,FITC （488-525）,Common Laser Lines,荧光信号,荧光素标记特异抗体 荧光素吸收激光能量，
15、产生跃迁 回到基态，荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能，释放较入射光波长更长的光量子 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强,双激光立体空间激发系统,双激光，两点激发，实现4色荧光分析 最大程度地减少荧光信号之间的补偿，提高检测灵敏度 双激光的应用大大扩展了染料的选择范围，亦相应地扩大了仪器的应用领域,33,当细胞携带两种荧光素如PE和FITC, 受激光激发而发射 出两种不同波长的荧光时，理论上，可选择滤片使每种荧 光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。 但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽 然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定 的重叠，FITC探测器会探测到少量的PE光谱，而PE探测器 则检测到较多的FITC光谱。克服这种误差的最有效方法是 使用荧光补偿电路,光谱重叠的校正,34,35,流式细胞仪可检测到的细胞参数,1 前向角散射（FSC）：前向角散射光的强度与细胞的大小有关，也就是说，同一个细胞群体，FSC强的，其细胞大一些，而FSC弱的，其细胞小一些。 2 侧向角散射（SSC）：侧向角散射又称90散射或大角散射。侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞内较大的颗粒也会有反应。所以，侧向角散射光的强弱可反应细胞内精细结构和颗粒的性质。,36,3 荧光
