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1、第四章 序列特征分析,Analysis of Sequence Characterristics,天津医科大学 王兆月,第一节 引言,一、基因结构,Section 1 Introduction,基因的概念是随着遗传学、分子生物学、生物化学等领域的发展不断完善的。从分子生物学角度来看，基因是负载特定生物遗传信息的DNA分子片段，在一定的条件下能够表达这种遗传信息，产生特定的生理功能。,原核生物基因结构：,一个完整的原核基因结构是从基因的5端启动子区域开始，到3端终止区域结束。基因的转录开始位置由转录起始位点确定，转录过程直至遇到转录终止位点结束，转录的内容包括5端非翻译区、开放阅读框及3端非翻译
2、区。基因翻译的准确起止位置由起始密码子和终止密码子决定，翻译的对象即为介于这两者之间的开放阅读框ORF。,操纵子模型结构,原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。所谓操纵子通常由调节基因、启动子、操纵基因以及2个以上的编码序列（结构基因）在原核生物基因组中成簇串联组成。其中结构基因的表达受到操纵基因的调控。调节基因能产生作用于操纵基因的阻遏物（一种蛋白质），操纵基因靠近它所控制的结构基因，阻遏物与操纵基因的结合能阻止结构基因的转录。,真核生物基因结构：,一个完整的真核生物基因，不但包括编码区域，还包括5端和3端两侧长度不等的特异性序列，虽然这些序列不编码氨基酸，却在基因表达的过程中起
3、着重要的作用。所以，严格的“基因”这一术语的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA所必须的全部核苷酸序列。,二、蛋白质结构,蛋白质是一种生物大分子，蛋白质中相邻的氨基酸通过肽键形成一条伸展的肽链，这条链称为蛋白质的一级结构，不同蛋白质其肽链的长度不同，肽链中不同氨基酸的组成和排列顺序也各不相同。肽链上的氨基酸残基形成局部的二级结构，各种二级结构在空间卷曲折叠形成特定的三维空间结构。有的蛋白质由多条肽链组成，每条肽链称为亚基，亚基之间又有特定的空间关系，称为蛋白质的四级结构。,蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构决定二级结构 蛋白质的二级结构决定三级结构,蛋白质的二级结构,H表示螺旋 E表示
4、折叠 B表示桥 G表示3-螺旋 I表示螺旋 T表示氢键转角 S代表转向,蛋白质空间结构,蛋白质的生物学功能在很大 程度上取决于蛋白质的空间结构， 但蛋白质的空间结构又取决于蛋白 质一级结构中的氨基酸组成和排列 顺序，蛋白质结构构象多样性导致 了不同的生物学功能。蛋白质分子只有处于它自己特定的空间结构情况下，才能获得它特定的生物活性，空间结构稍有破坏，就很可能会导致蛋白质生物活性的降低甚至丧失，因为它们的特定的结构允许它们结合特定的配体分子。知道了基因密码，科学家们可以推演出组成某种蛋白质的氨基酸序列，却无法绘制蛋白质空间结构。因而，揭示人类每一种蛋白质的空间结构，已成为后基因组时代的制高点，这
5、也是结构基因组学的基本任务。,对DNA序列和蛋白质序列进行序列特征分析，能够使我们从分子层次上了解基因的结构特点，了解与基因表达调控相关的信息，了解DNA序列与蛋白质序列之间的编码，了解蛋白质序列与蛋白质空间结构之间的关系和规律，为进一步研究了解蛋白质功能与蛋白质结构之间的关系提供理论依据。,第二节 DNA序列特征分析,Section 2 Analysis of DNA Sequence Characteristics,分析DNA序列，除了进行序列比对之外，更重要的工作是从序列中找到基因及其表达调控信息。寻找基因的工作有两个：一是识别与基因相关的特殊序列信号，如启动子、起始密码子，通过信号识别
6、大致确定基因所在的区域；二是预测基因的编码区域，或预测外显子所在的区域。在此基础上，结合两个方面的结果确定基因的位置和结构。绝大部分基因表达调控信息隐藏在基因序列的上游区域，在组成上具有一定的特征，可以通过序列分析识别这些特征。,一、开放阅读框ORFopen reading frame,开放阅读框指的是从5端开始翻译起始密码子（ATG）到终止密码子（TTA、TAG、TGA）的蛋白质编码碱基序列。每个序列都有6个可能的开放阅读框，其中3个开始于第1、2、3个碱基位点并沿着给定序列的5 3的方向进行延伸，而另外的3个开始于第1、2、3个碱基位点但沿着互补序列的5 3的方向进行延伸。在开始这项工作之
7、前，我们并不知道DNA双链中哪一条单链是编码链，也不知道准确的翻译起始点在何处，由于每条链都有3种可能的开发阅读框，2条链共计6种可能的开放读框，我们的目的就是从这6个可能的开放阅读框中找出一个正确的开放阅读框。根据这个开放阅读框翻译得到的氨基酸序列才是真正表达的蛋白质产物。,真核生物的开放阅读框,真核生物的开放阅读框不仅含有编码蛋白的外显子（exon），而且还有内含子（intron），并且内含子将开放阅读框分割为若干个小片段。开放阅读框的长度变化范围非常大，因此真核生物的基因预测远比原核生物困难。但是，在真核生物的开放阅读框中，外显子与内含子之间的连接绝大部分情况下满足GT-AG规律：内含子
8、序列 5 端的起始两个核苷酸总是GT，并且其3端的最后两个核苷酸总是AG，即：5-GT AG-3，这个规律有助于真核生物开放阅读框的识别。,利用GENSCAN识别基因开放阅读框,GENSCAN是美国麻省理工学院的Chris Burge于1997年开发成功的人类（或脊椎动物）基因预测软件，它是根据基因组DNA序列来预测开放阅读框及基因结构信息的开放式在线资源，尤其适用于脊椎动物、拟南芥和玉米等真核生物。 GENSCAN的网址为： http：/genes.Mit.edu/GENSCAN.html,GENSCAN在线操作页面,用GENSCAN预测AC002390序列的基因/外显子,用GENSCAN预
9、测AC002390序列的基因/外显子的位置图,起始外显子,终止外显子,二、CpG岛 CpG islands,CpG岛是指DNA序列上的一个区域，此区域含有大量相联的胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G），以及使两者相连的磷酸酯键（p）。CpG岛的概念是Gardiner-garden和Fromner于1987年提出的，基因中平均每100 Kb即可出现。CpG岛位于基因的启动子和第一个外显子区，约有60%80%的人类基因的启动子和起始外显子含有CpG岛，其中GC含量大于50%，长度超过200bp。因此搜索CpG岛可以为基因及其启动子预测提供重要线索。,利用CpGPlot预测分析CpG岛,CpGPlot是预测C
10、pG岛的在线工具，它是由欧洲分子生物学实验室EMBL European Molecular Biology Laboratory提供的。 其网址为：http:/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html,CpGPlot在线操作页面,用CpGplot预测AC002390序列的CpG岛的结果,用CpGReport预测AC002390序列的CpG岛的结果,三、转录终止信号,转录终止信号是在mRNA序列的3端终止密码子下游位置上的加尾信号（tailing signal）。前体mRNA 3端多聚腺苷酸化是真核细胞内mRNA转录后处理的三个最主要步骤之一，这
11、三个步骤包括：5帽子结构的形成、内含子的剪切及3端的多聚腺苷酸化，因此，前体mRNA 3端多聚腺苷酸化与mRNA稳定性的调节、mRNA的细胞内转运、翻译的起始以及一些其他的细胞机制和疾病机制有着重要关系。,真核生物前体mRNA3端的多聚腺苷酸化包括两个步骤：,1. 特异性的核苷酸内切酶在PolyA位点处进行断裂； 2. 腺苷酸聚合酶在断裂位点处添加PolyA尾巴，其主要标志 为AATAAA或ATTAAA两种序列，称为多聚腺苷酸信号 （polyadenylation signal），简称PolyA信号序列，也称为 转录终止信号。 在3UTR区存在多个潜在PolyA位点，因此对PolyA位点的准确
12、识别，对于预测基因结构、理解mRNA的形成机制及某些疾病的分子机制具有巨大的作用。,利用POLYAH预测分析转录终止信号,SoftBerry网站的POLYAH软件是识别3端剪切和PolyA区域的在线工具。 其网址为： ,POLYAH在线页面,用POLYAH预测AC002390序列的转录终止信号的结果,四、启动子promoters,启动子是基因的一个组成部分，是位于结构基因5端上游区的DNA序列，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的蛋白质结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥RNA聚合酶的活动。如果基因的启动子部分发生突变
13、，则会导致基因表达的调节障碍。这种突变常见于恶性肿瘤。,利用PromoterScan预测分析启动子区域,BioInformatics and Molecular Analysis Section网站的PromoterScan软件是预测分析启动子区域的在线工具。 其网址为： http:/www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/,PromoterScan在线网页,用PromoterScan预测AC002390序列的启动子区域的结果,五、密码子偏好性,密码子使用偏性是指生物体中编码同一种氨基酸的同义密码子的非均匀使用现象。这一现象的产生与诸多因素有关，如基因的表达水
14、平、翻译起始效应、基因的碱基组分、某些二核苷酸的出现频率、G+C含量、基因的长度、tRNA的丰度、蛋白质的结构及密码子一反密码子间结合能的大小等。所以对密码子使用偏好性的分析具有重要的生物学意义。,利用CodonW分析密码子偏好性,CodonW是美国DEC公司开发的对密码子的使用进行分析的免费的软件工具。此软件是建立在大量的统计学分析的基础上，为了简化在线分析的复杂性而开发的，它可以在Windows环境下运行，并且可以同时处理2000条以上的序列。通过对DNA或RNA序列的分析，CodonW会产生关于密码子使用的相关指标的统计学分析的数据，我们可以利用这些数据对我们所要了解的序列进行分析。 其
15、下载网址为：ftp:/molbiol.ox.ac.uk/cu/codonW.tar.Z。,CodonW1.4主菜单的操作页面,11个密码子使用的指标,waxy基因的序列,用CodonW分析waxy基因所得的RSCU值 和 个数,第三节 蛋白质序列特征分析,Section 3 Analysis of Protein Sequence Characteristics,蛋白质是组成生物体的基本物质，是生命活动的主要承担者，一切生命活动都与蛋白质有关。虽然遗传信息的携带者是核酸，但遗传信息的传递和表达不仅要在酶的催化之下，并且也是在各种蛋白质的调节控制下进行的。因此，分析处理蛋白质序列数据的重要性并不
16、亚于分析DNA序列数据。蛋白质的生物功能由蛋白质的结构所决定，因此在研究蛋白质的功能时需要了解蛋白质的空间结构。,目前，一种基本认可的假设是：蛋白质的空间结构由蛋白质序列所决定，即我们可以根据蛋白质序列预测蛋白质结构，这是第二遗传密码的问题，也是一个更为复杂的问题，因为蛋白质序列和蛋白质空间结构之间的关系要比DNA序列和蛋白质序列之间的关系复杂得多。因此我们需要分析大量的数据，从中找出蛋白质序列和蛋白质结构间存在的关系和规律。,一、蛋白质的理化性质,蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，对组成蛋白质的氨基酸进行理化性质的统计分析是对一个未知蛋白质进行分析的基础。蛋白质的理化性质包括蛋白质的分子量、氨基酸的组成、等电点、消光系数、亲水性和疏水性、跨膜区、信号肽、翻译后修饰位点等。,利用ProtParam分析蛋白质的理化性质,ExPASy（Expert Protein Analysis System）是由瑞士生物信息学中心维护，并与欧洲生物信
