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1、青岛大学 硕士学位论文 地塞米松和西比灵对庆大霉素耳毒性的保护作用 姓名：张俊瑶 申请学位级别：硕士 专业：耳鼻咽喉头颈外科 指导教师：朱富高 20100520 摘要 目的探讨地塞米松和西比灵对庆大霉素耳毒性的保护作用。 方法4 0 只豚鼠随机分为5 组，庆大霉素组( G 组) 每日肌注庆大霉素1 5 0 m g k g ，腹 部皮下注射生理盐水0 5 m l 。保护组：D F 组每日J 玑注庆大霉素1 5 0 m g k g ，腹部皮下 注射地塞米松3 m g k g ，西比灵3 m g k g 灌胃；D 组每日肌注庆大霉素1 5 0 m g k g ，腹 部皮下注射地塞米松3 m g k
2、g ，F 组每日肌注庆大霉素1 5 0 m g k g ，西比灵3 m g k g 灌 胃。对照组每同肌注生理盐水3 m l k g ，腹部皮下注射生理盐水0 5 m l ；每组均连续用 药1 4 天。每组动物用药前1 天行听性脑干反应( A B R ) 检查，停药后1 天行听性脑干 反应( A B R ) 检查和耳蜗基底膜组织学观察，比较各组间A B R 各波潜伏期及波间期、 苏木素染色后毛细胞形态、T U N E L 染色凋亡阳性毛细胞计数。 结果用药前各组动物A B R 波间期及潜伏期差别无统计学意义( P O 0 5 ) 。停药后庆 大霉素组和保护组的各波潜伏期和波间期均较对照组延长(
3、 P O 0 5 ) ，保护组中D F 组和F 组各波潜 伏期和波间期的时间明显短于庆大霉素组( P O 0 5 ) ，D F 组中，除I 波潜伏期外，其他各波潜 伏期和波间期较F 组短( P O 0 5 ) 。D F 组和F 组凋亡毛细胞数较庆大霉素组少，差别有统计学意义( P O 0 5 ) 。图4 为T U N E L 染色后耳蜗基底膜，图中凋亡毛细胞呈棕黄色或 褐色。 6 青岛大学硕士学位论文 1 l I I o i l tj 1j 5i 7j1 犷ii i0 ；，；- j1 ；ii I 1 “ 2m 图l - 1 用药前对照组A B R 图形 图1 2 用药前庆大组A B R 图形
4、剐h i j：，了j 了之1 一i矗； r r ；丁i5 j 。 南一i 图1 4 用药前F 组A B R 图形 图1 5 用药前D 组A B R 图形 7 、I s 妯I ff 。l h - ” 。，m m ，r h 1 图1 - 3 用药前D F 组A B R 图形 材料与方法 一_ 一 旧。t、 图2 1 停药后对照组A B R 图形 图2 2 停药后庆大组A B R 图形 图2 3 停药后D F 组A B R 图形 轴L f b 蛹 一 奎l 弘，卜： 图2 4 停药后F 组A B R 图形 图2 5 停药后D 组A B R 图形 重 青岛大学硕士学位论文 表1 1 用药前后各组豚鼠A
5、 B l l 各波潜伏期比较( m s ，i S ) 测试组别 潜迭翅 时间I 波 I 波V 波 一 C 组1 3 0 + 0 1 7 2 4 5 + 0 2 9 4 6 3 + 0 2 3 G 组 用药前D F 组 D 组 F 组 C 组 G 组 停药后D F 组 D 组 1 2 3 _ + 0 1 92 3 2 0 2 6 4 6 4 0 2 2 1 3 8 _ + O 2 8 2 4 3 0 3 24 7 0 4 - 0 3 4 1 3 3 4 - O 2 2 2 5 0 0 3 64 6 4 _ + 0 2 9 1 2 9 _ + O 1 7 2 3 6 0 2 3 4 6 4 0 2
6、 3 1 3 9 + O 1 2 2 5 1 4 - 0 2 64 7 5 + O 1 3 1 8 3 + O 1 1 静 3 7 5 + 0 1 5 ”瑶6 8 4 + 0 2 l 她 1 6 1 0 1 3 2 9 2 0 1 1 。 5 2 1 O 1 2 ” 1 9 0 + O 1 7 ”3 7 7 + O 4 4 “蕞 6 9 6 + O 2 9 ”囊 F 组1 7 5 + O 1 2 ”3 2 9 _ + O 2 8 蚍 6 2 8 + O 5 5 蚍 注a ： 停药后与朋约前同组比较P O 0 5 注b ：木停药后各组与C 组比较P O 0 5 注e ：k 停药后各组与D F 组
7、比较P O 0 5 注d ：停药后各组与F 组比较P O 0 5 表1 2 用药前后各组豚鼠A B R 各波波间期比较( m s ，i S ) 测试组别 渡闻期 时间I - I I I I I I VI V C 组1 1 5 + 0 1 52 1 8 0 1 2 3 3 3 + _ O 0 6 G 组 用药前D F 组 D 组 F 组 C 组 G 组 停药后D F 组 D 组 1 0 7 0 0 8 2 3 2 0 1 03 3 7 0 0 5 1 0 5 4 - 0 0 7 2 2 7 0 0 63 3 2 0 0 7 1 1 7 0 1 62 1 6 0 0 9 3 3 1 0 0 7 1
8、 0 8 0 1 02 2 8 0 1 2 3 3 4 0 0 6 1 1 4 0 1 4 2 2 4 0 1 5 3 3 6 0 0 3 1 9 2 + 0 0 6 ”3 0 7 + O 0 6 ” 壤 5 0 1 O 1 0 ” 1 3 1 0 0 8 4 1 9 8 + O 1 0 ” 2 2 8 0 0 5 3 5 9 0 0 6 4 3 0 2 + O 0 8 ”5 0 5 + 0 1 2 ” F 组 1 6 5 + O 2 7 ” 2 8 3 + O 2 7 ”4 5 2 + O 5 5 ” 9 材料与方法 _ - 一 注a ：# 停药后与用药前同组比较P O 0 5 注b ：宰停
9、药后各组与C 组比较P 0 0 5 注c ：停药后各组与D Ff l l t t ：g EP 0 0 5 注d ：停药后各组与F 组比较P O 0 5 表2 停药后各组耳蜗基底膜第二回T U I q E L 阳性细胞计数比较( 个，x S ) 组别 阳性细胞数 C 组 G 组 D F 组 D 组 F 组 6 0 0 1 5 8 4 2 0 0 + 5 9 5 。 2 0 4 0 4 0 4 * 4 0 8 0 5 8 1 壤 2 5 2 0 5 3 6 注a ：木与C 组比较P 0 0 5 注b ：与D F 组比较P O 0 5 注c ：与F 组比较P 0 0 5 圆 C 图3 1 对照组(
10、x 4 0 0 ) 图3 2D F 组( X 4 0 0 ) 图3 3 庆大组( x 4 0 0 ) 1 0 青岛大学硕士学位论文 _ _ 一 图3 4F 组( X 4 0 0 ) 图3 5D 组( X 4 0 0 ) 注：图3 为耳蜗基底膜苏木素染色图片 图4 1 对照组( x 4 0 0 ) 图4 2D F 组( X 4 0 0 ) 图4 3 庆大组( X 4 0 0 ) 图4 4F 组( X 4 0 0 ) 图4 5D 组( X 4 0 0 ) 注：图4 为耳蜗基底膜T U N E L 染色图片，箭头所示为凋亡阳性细胞 讨论 第3 章讨论 3 1 氨基糖苷类抗生素听觉系统损伤与A B R
11、 的关系 r A B R 是检测听觉系统损伤较为敏感的方法，A B R 的I 波起源于听神经近蜗端的动作 电位或为与毛细胞相连接的听神经树突的突触后电位，因而毛细胞的损伤会引起波I 的变化。氨基糖苷类抗生素发生耳毒性时对毛细胞的损害己成共识，A B R 波I 的变化是 耳毒性损伤的直接证据。I 波主要来自同侧耳蜗核，Z e n gC 等阳3 人研究发现卡那霉素 可以使耳蜗核内谷氨酸运载体明显减少。谷氨酸运载体则是听神经纤维将信号传入耳 蜗核的主要神经递质嘲。由此可见氨基糖苷类抗生素的耳毒性对A B R I I I 波也有影响。A B R V 波来自下丘，M u l d e r sw H 和R
12、o b e r t s o nD 研究n 驯发现庆大霉素能阻断下丘电刺激引 起的各种效应，因而对A B RV 波也有影响。本实验中庆大霉素组的各波潜伏期和波间 期均较实验前及对照组延长，说明庆大霉素耳毒性模型成功，A B R 各波潜伏期及波间期 的统计，对庆大霉素耳毒性损失程度的比较是有意义的。 3 2 氨基糖苷类抗生素耳毒性与内耳细胞凋亡的关系 细胞凋亡是指细胞在各种凋亡因子刺激下发生的，受基因调控的细胞自杀性行 为，存在于正常生理情况下，是在个体发育、多细胞生物体平衡和疾病发生中起重要 作用的一种细胞死亡形式。传统观念认，氨基糖苷类抗生素致毛细胞死亡是通过坏死 实现的，然而，许多研究n “
13、1 2 1 结果显示，氨基糖苷类抗生素引起毛细胞死亡的主要方式 是凋亡，在氨基糖苷类抗生素耳毒性发生过程中，细胞凋亡级联反应被启动，最终导 致细胞凋亡。现已发现与细胞凋亡密切相关的信号传导系统有十余个，L e e 等n 3 1 通过实 验观察到，线粒体介导的凋亡通路在氨基糖苷类抗生素致前庭细胞凋亡中起了重要作 用，在新霉素致凋亡的毛细胞中有C a s p a s e 一3 ，C a s p a s e - 9 的活化和细胞色素C 的分布。 丁大连等钔用庆大霉素和利尿酸钠注射灰鼠的实验中发现，耳蜗毛细胞凋亡过程中都 出现C a s p a s e 一9 和C a s p a s e 一3 的表达
14、，但是没有发现C a s p a s e 一8 的活动。鉴于 1 2 青岛大学硕+ 学位论文 C a s p a s e 一9 是线粒体病变引起的细胞凋亡途径中的首要启动环节，而C a s p a s e - 8 仅对 细胞膜的细胞死亡因子受体刺激起反应，因此判定庆大霉素引起的毛细胞凋亡主要是 通过线粒体途径。但也有学者n 5 1 对氨基糖苷类药物耳毒性的研究发现毛细胞凋亡的发 生与胞内C a 2 + 浓度的暂时性升高、c - j u n 途径激活及线粒体信号途径密切相关。由此可 见内耳毛细胞的凋亡是由多种途径共同参与。 在凋亡过程中染色体会裂解为大量D N A 片段，T U N E L 技术是通过标记凋亡中产生 的细胞核内D N A 3 一羟基端来显示凋亡细胞的，已被广泛用于生物和医学研究领域，并 认为是目前原位检测细胞凋亡最敏感而快速的手段。本实验中可观察到庆大霉素组的 凋亡毛细胞明显多于对照组，在正常生理状态下也会有细胞发生凋亡，因此，对照组 中也有T U N E L 染色阳性细胞。 3 3 糖皮质激素与内耳毛细胞凋亡的关系 细胞凋亡的过程中均伴有凋亡相关基因的表达调控。根据其作用的不同，可分为 促进凋亡基因、抑制凋亡基因及具有双重作用
