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1、重金属降解微生物,指导教师：马小魁 小组成员：杨雪 任冬妮 陈雨 色林格,研究背景与一些概念 微生物对重金属的作用机理 重金属降解微生物的应用技术,重金属降解微生物的介绍,重金属危害的途径,Cr,Cu,Ni,Zn等重金属元素是微生物的必须元素，它们在微生物生化反应中起催化剂作用，并稳定蛋白质结构、细胞壁及渗透压平衡。 Ag，Hg，Pb，Cd等重金属元素是微生物的非必需元素，它们与必须元素竞争取代微生物细胞上的结合位点，与配基反应，产生毒害作用。导致核酸、蛋白质构象改变，干扰氧化磷酸化和渗透压平衡。 如：微生物蛋白质合成的启动阶段需要Mg离子的参与，在重金属污染的环境下，Mg离子被重金属发生交换
2、，使蛋白质合成受阻。,重金属在微生物生长代谢过程中起重要作用,因此，在自然环境的选择压力下，微生物进化出了各种不同的抗性机制。,重金属降解微生物：利用微生物对重金属具有一定的抗性和解毒作用，可以吸附和转化重金属的特性，用以消除重金属污染、提取贵重金属的一类微生物。,重金属降解微生物,(一)微生物对重金属的抗性机制,吸附作用,细胞壁是金属进入微生物胞内的第一屏障。 通过静电吸附和官能团（如-COOH、-NH2、-OH、-PO43等）络合固定，微生物提供重金属结合位点，减少向胞内进行运输重金属，保护敏感细胞器。而对于细胞化学反应需要的金属则可以通过细胞壁运输到原生质中的特定位点。,细菌细胞壁表面带
3、有负电荷 蓝细菌、真菌和一些藻类可以产生带有负电荷的胞外多糖 它们都可与有害重金属静电结合,络合离子Cu(NH3)42+,胞外沉淀,分泌胞外蛋白等物质，与重金属结合形成复合物沉淀，使之不能通过细胞膜进入胞内。,胞内隔绝,当重金属进入胞内并有所积累，胞内隔绝会阻止其对重要细胞器的毒害。 如：真核微生物如藻类、酵母和真菌将重金属累积于胞内某些特殊细胞器中,主动运输,是一种最主要的重金属抗性机制，由染色体和质粒编码 主动输出系统，将重金属从胞浆中排出，由多条路径构成。 依赖能量代谢调控，受温度、能源物质和抑制物影响。 据能量来源可将输出系统分为两类： 1、由ATP水解供能的输出途径 2、由质子梯度供
4、能的输出途径,结合蛋白E,ATP,N个 Cd2-,ADP,P,N个 Cd2-,转化解毒,重金属离子一旦进入微生物细胞，可通过氧化、还原、甲基化或去甲基化转化成价态稳定、毒性较小或无毒的化合物，从而减轻对生物体的毒害作用。 其中抗性基因编码解毒酶，催化高毒性金属转化为低毒状态。,总结,微生物的抗性机制有物理性质（静电吸附）、化学性质（络合）、生物性质（特异抗性基因编码的途径），它们都不是各自孤立的，而是由微生物基因编码调控，互相配合、共同作用的。 如：细胞酶系的改变与物质合成位点的抑制,使菌体原生质膜发生成分与通透性的变化；脱硫弧菌通过细胞色素和氢化酶还原Cr6+至Cr3+，并在表面形成沉淀。
5、是由外界环境改变而引起微生物基因调控的一种自我保护机制。因此，抗性菌株的产生即是其在恶劣环境中优胜劣汰的结果。,微生物对重金属的抗性多是由染色体外的质粒或转座子上的抗性基因决定。抗性基因编码金属解毒酶催化高毒性金属转化为低毒形态,其中对微生物汞的转化研究最为清楚。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中都发现了 Hg2 +抗性菌株。它们含有一套 Hg2 +抗性操纵子(mer),可编码重金属解毒酶、编码调节蛋白、周质结合蛋白、细胞膜转移蛋白。不但对重金属解毒,还具有运输及自我调节等一系列功能。 Hg2 +抗性操纵子(mer)可编码2个解毒酶。第一个是有机汞裂解酶,催化反应式为: RHgX + H+ X RH
6、 + HgX2 第二个为汞还原酶,催化反应式: Hg(SR) 2 + NADPH + H+ Hg(0) + NAPDH+ 2RSH 产生的金属汞穿过细胞膜,重新释放到周边环境中。,重金属降解微生物的应用技术 微生物修复技术,微生物淋滤技术,利用微生物的直接转化作用或其代谢产物的间接转化作用 ，产生氧化、还原、络合、吸附或溶解作用，将固相中某些不溶性成分(如重金属、 硫及其它金属)分离浸提出来的一种技术 。 可用于难浸提矿石或贫矿中金属的溶出与回收，又称微生物湿法冶金。 一些嗜酸细菌被广泛用于铜、金等金属的浸提。如在氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌作用下，污泥中难溶性金属硫化物被氧化成金属硫酸盐而溶
7、出，通过固液分离即可达到取出或提取重金属的目的。,微生物表面展示技术,表面展示技术:利用基因工程手段，将外源目的基因克隆到特定的表达载体中， 使其表达产物（重金属结合肽）与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。 融合蛋白赋予微生物对重金属的亲和力，或增强其原本的亲和能力。如：通过多肽上的组氨酸和半胱氨酸等氨基酸残基，实现对重金属的亲和吸附。,微生物表面展示技术,重金属结合多肽可以是从抗性菌株中获得的天然多肽，也可以是人工改造的更高效的合成多肽。,组氨酸Histidine (图左） 半胱氨酸（图右）：与Ag+，Hg+，Cu+等金属离子可形成不溶性的硫醇盐。即RSM，
8、 RSMSR（M， M各为1价、2价金属）。,细菌表面展示技术,目前 ,已经开发出几个以外膜蛋白、 纤毛和鞭毛为基础的细菌展示系统 ,纤毛与其他载体分子相比有某些优点 ,它大量呈现在细菌表面 ,与环境持续接触。 构建重复多肽，如六聚组氨酸多肽、162 个氨基酸的多聚组氨酸等，可以通过细菌表面展示用于重金属降解修复。可以提高抗性菌种对某一重金属的结合能力，而且往往成倍提高。,酵母表面展示技术,作为生物吸附剂的表面工程酵母菌 ,其特性依赖于展示蛋白结合金属离子的能力 ,细胞表面对重金属离子的吸附在细胞对金属离子毒性的抗性能力方面起主要作用。,噬菌体表面展示技术,将外源DNA片段插入噬菌体编码蛋白的
9、基因P或P中，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。 该技术将蛋白质分子的表型和基因型巧妙地结合于噬菌体这样一个便于对其进行一系列生化和遗传操作的载体上，从而大大简化了蛋白质分子表达文库的筛选和鉴定。,噬菌体随机肽库展示技术,方法： 1、合成多组一定长度的随机寡核苷酸的片段，并插入到噬菌体内与其表面蛋白基因融合。 2、噬菌体大量复制，并表达形成融合蛋白而展示出来。 3、通过与靶分子（重金属）结合，筛选具有目的多肽的特异重组噬菌体。 肽库：即由大量带有不同肽段的单个噬菌体组成的重组噬菌体库。,噬菌体随机肽库展示技术,该技术的主要特点： 1、将特定分
10、子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。 2、这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。 3、筛选获得的多肽基因可导入工程菌细胞内表达，增强其对某一重金属的降解，或增加其可降解的重金属种类。,植物菌根修复技术,利用微生物对重金属各种降解机制、植物忍耐和超量积累重金属的特性，将重金属污染物降解或转移的方法。 微生物死亡分解或环境条件改变，会导致细菌固定的重金属部分活化而重新释放到环境中。 植物及其根际微生物体系，协调形成菌根，将重金属积累到超富集植物体中，从而彻底从环境中清除出
11、去。两者结合，能使两者对重金属的耐受能力同时增强 。 其技术核心在于筛选有较强降解能力的菌种和适宜的共生植物,从而得到有效的菌根。,根菌对重金属修复的作用,1、通过菌类分泌特殊的分泌物改变植物根际环境 。改变重金属的存在状态 ,降低重金属毒性。 2、影响植物对重金属的积累和分配 。使植物体内重金属积累量增加 ,提高植物的富集效果。 3、向植物传递营养 ,使幼苗成活率提高 ,抗逆性增强、生长加快 。间接地促进对重金属的修复作用。,异位修复技术,异位修复技术：将受污染的土壤挖出后用化学物理方法清洗、焚烧处理、热处理及生物反应器等多种方法治理, 这是早期常用的方法。 生物反应器：将预处理的土壤调和至
12、泥浆状，放入带有机械搅动装置的反应器内，调节温度和pH值，补充必要的营养和氧气,使污染物达到最大程度降解。 由于需要对污染的土壤进行大范围的扰动，缺点: 处理成本高; 很难治理深度大的污染区; 破坏原土壤结构及生态环境等。,原位修复技术,原位修复技术:在不破坏土壤基本结构的情况下的微生物修复技术。 有投菌法、 生物培养法和生物通气法等。 1、投菌法：直接向污染土壤中接入高效降解菌,同时提供给这些微生物生长所需营养的过程。 2、生物培养法：定期向受污染土壤中加入营养和氧或 H2O2 作为微生物氧化的电子受体,以满足污染环境中已经存在的降解菌的需要。 3、生物通气法：采用真空梯度井等方法把空气注入
13、污染土壤以达到氧气的再补给,可溶性营养物质和水则经垂直井或表面渗入的方法予以补充。可用于石油污染的修复。,微生物修复技术的局限性,(1)一种微生物只能降解特定一种或几种重金属，而非所有重金属。 (2)特定的微生物只降解特定类型的化学物质,状态稍有变化的化合物就可能不会被同一微生物酶所破坏。 (3) 特定污染地点或污染物可能限制修复技术的应用，如在一些低渗透的土壤中可能不宜使用微生物修复,因为这类土壤或在这类土壤中的注水井会由于细菌生长过多而阻塞。 (4) 微生物修复技术受各种环境因素的影响较大,因为微生物活性受温度、 氧气、 水分、 pH等环境条件的变化影响。与物理法、 化学法相比,这一技术治理污染的时间相对较长。 (5)有些情况下,生物修复不能将污染物全部去除,当污染物浓度太低,不足以维持降解细菌的群落时,残余的污染物就会留在土壤中。,如何获得高效降解菌株？,谢谢!,
